Uncovering the regulatory T cell transcriptional signature in the human thymus

Abstract

Os linfócitos T reguladores (Tregs) desempenham um papel crucial na manutenção da homeostasia imunológica, impedindo ou limitando respostas imunes. As Tregs são particularmente eficazes a suprimir as células T convencionais (Tconvs), e desta forma limitam a imunopatologia associada à imunidade contra patogéneos e células cancerígenas, bem como os processos alérgicos, autoimunes e inflamatórios. Uma população significativa de Tregs é gerada durante o desenvolvimento das células T no timo conhecidas como Tregs naturais (ou derivadas do timo), sendo definidas pela presença da proteína FOXP3. Este fator de transcrição desempenha um papel crucial na diferenciação destas células, não só através da repressão de genes normalmente expressos em Tconvs, mas também promovendo a ativação de genes específicos de Tregs, incluindo IL2RA (CD25) e CTLA4. No entanto, vários estudos demostraram que a diferenciação e comprometimento destas células pode ser independente de FOXP3, indicando a existência de outros fatores, atualmente desconhecidos, os quais são suficientes para promover o desenvolvimento das Tregs. Neste estudo, investiguei a diferenciação e o comprometimento das células Treg no timo humano, a fim de identificar novos fatores potencialmente envolvidos nesta decisão. Para isso, isolámos Tregs e Tconvs tímicas maduras CD4 positivas com base na expressão dos marcadores CD27, CD25 e CD127, a partir de tecido tímico humano removido durante cirurgias cardíacas pediátricas corretivas de três indivíduos, e geramos os seus respetivos perfis de expressão génica através da sequenciação do RNA (RNA-seq).A nossa análise da comparação da transcrição identificou 1047 genes significativamente e diferencialmente expressos entre tTregs e tTconvs, dos quais 648 com sobre expressão em tTregs. Destes 648 genes, observei a expressão proeminente de alguns genes associados a este tipo celular, incluindo FOXP3, IL2Rα (CD25), CTLA4, TNFRSF4 (OX40), TNFRSF18 (GITR), IKZF2 (HELIOS) e IKZF4 (EOS). Para alem disso, identifiquei um conjunto de 196 genes unicamente expressos em tTreg em comparação com tTconv, alguns dos quais codificam proteínas com conhecida relevância na biologia destas células, incluindo TNFRSF8 (CD30), LRRC32 (GARP) e CCR8, bem como genes cuja função em tTregs é desconhecida, nomeadamente DNAH8 e TNFRSF11A. Enquanto a expressão de DNAH8 pode ser indicativa da formação de sinapses imunológicas, a expressão de TNFRSF11A pode sugerir um mecanismo adicional de supressão através dos quais as tTregs previnem a ativação das tTconvs.Dos genes encontrados sobre expressos nas tTregs em comparação com as tTconvs, 46 codificam fatores de transcrição. Estes incluem alguns já conhecidos como estando diretamente envolvidos na diferenciação destas células, como FOXP3, IKZF2, IKZF4, FOXO1 e NR4A3, bem como fatores de transcrição envolvidos na ativação e diferenciação de Tconvs, como o TBX21, IRF4, STAT4, BATF e RORA. Além disso, identifiquei também membros da via de sinalização NF-kB (REL, RELB e NFKB2), indicando o seu estado ativo durante a diferenciação destas células. Por fim, encontrei um grupo de fatores de transcrição sobre expressos em Tregs e sem funções previamente descritas nestas células, nomeadamente IRF5, ZBTB38, KLF6 e CREB3L2, o que sugere a presença de novas vias de regulação da transcrição envolvidas nos processos de diferenciação e função das células T reguladorasEm conclusão, esta tese apresenta o primeiro perfil de transcrição de Tregs e Tconvs de timo humano, cujas análises serão fundamentais para a compreensão do seu desenvolvimento. Até à data, estes dados permitiram a identificação de novos genes com funções desconhecidas nestes grupos celulares, o que poderá representar fatores adicionais envolvidos na definição das células T no timo. No futuro, estes dados permitirão explorar novas linhas de investigação com o objetivo de esclarecer o desenvolvimento da linhagem Treg no timo humano, bem como ajudar na definição da assinatura de expressão destas células.

Regulatory T cells (Tregs) are key players in maintaining immune homeostasis, by preventing or limiting immune responses. They are particularly efficient in suppressing conventional T cells (Tconvs), and in this way control the immunopathology associated with immunity against pathogens and cancer as well as preventing allergy, autoimmune diseases, and chronic inflammation. An important Treg subset is generated during T cell development in the thymus, known as thymic-derived Treg. It is best defined by the expression of the forkhead box protein FOXP3, a transcription factor that plays a crucial role in Treg cell differentiation by repressing the expression of genes otherwise upregulated in Tconv cells, as well as by promoting to the activation of Treg specific genes, including IL2Rα (CD25) and CTLA4. However, recent studies have shown that Treg commitment may occur independently of FOXP3, indicating that other factors, presently unknown, are sufficient for the generation of Tregs. Here I have investigated the differentiation and commitment of Treg cells in the human thymus, in order to identify novel factors potentially involved in this decision. To do this, we FACS sorted mature CD4 single-positive thymic Tregs (tTregs) and their conventional counterparts (tTconvs) based on the expression of CD27, CD25, and CD127 markers, from three human thymuses collected during pediatric corrective cardiac surgery, and generated their respective genome-wide expression profiles by RNA-seq. We ensure that these thymuses have an immunophenotype representative of all stages of T cell development and consistent with the one described in the literature.Our comparative transcriptomic analysis identified 1047 genes significantly differentially expressed between tTreg and tTconv subsets, with 648 of these up-regulated in tTregs. Amongst these, I observed the prominent expression of Treg-associated genes, including FOXP3, the IL2Rα (CD25), CTLA4, TNFRSF4 (OX40), TNFRSF18 (GITR), IKZF2 (HELIOS) and IKZF4 (EOS). From these, I identified a set of 196 genes that are uniquely expressed in tTreg compared to tTconv, encoding proteins with relevance to Treg biology, such as TNFRSF8, LRRC32, and CCR8, as well as others with no previously reported activity in tTreg cells, as DNAH8 and TNFRSF11A. Whilst DNAH8 expression may be indicative of the formation of immunological synapses, the expression of TNFRSF11A may indicate an additional suppression mechanism by which Tregs prevents Tconv cell activation. From the genes found to be up-regulated in tTreg cells compared to tTconvs, 46 were transcription factors. These include some known to be directly involved in Treg development, such as FOXP3, IKZF2, IKZF4, FOXO1, and NR4A3, as well as transcription factors involved in Tconv cell activation and differentiation, such as TBX21, IRF4, STAT4, BATF and RORA. In addition, several members of the NF-kB pathway (REL, RELB, NFKB2) are also up-regulated in tTregs, indicating the activated state of this pathway during tTreg differentiation. Importantly, a set of transcription factors with no previous reported role in human regulatory T cells, IRF5, ZBTB38, KLF6, and CREB3L2, are overexpressed in tTregs, suggesting additional layers of transcriptional regulation of Treg cell differentiation and function. Altogether, this thesis presents the first transcriptomic profile of the human thymic Treg and Tconv subsets, which analyses are absolutely necessary to the understanding of their development. So far, they allowed the identification of novel genes with unreported functions in these subsets, which might represent additional factors involved in the definition of thymic T cells; in the near future, these data will open several new lines of research aiming to clarify the pathways of Treg lineage commitment in the human thymus and will help in the definition of the expression signature of human tTreg subset.