Effect of naphthoquinones in Meloidogyne luci life cycle and evaluation of their recovery through gene expression analysis

Abstract

Os nemátodes das galhas radiculares (NGR), Meloidogyne spp., são um grupo de nemátodes polífagos, distribuídos mundialmente, com grande impacto económico. Meloidogyne luci, uma espécie emergente, descrita pela primeira vez em 2014, e reportada em Portugal em 2018 e 2019, foi adicionada à lista de alerta da EPPO em 2017. Os objetivos deste estudo foram desenvolver uma metodologia molecular para a identificação de M. luci, e avaliar o efeito de 1,4-naftoquinona (1,4-NTQ) no seu ciclo de vida e expressão de genes, para o desenvolvimento de uma potencial estratégia de controlo sustentável. Um isolado português de M. luci foi caracterizado bioquimicamente (análise do padrão de esterases) e molecularmente. A análise do padrão de esterases permitiu a identificação e diferenciação de M. luci (L3). A análise da região do DNA mitocondrial entre os genes COII e 16S rRNA resultou em produtos de amplificação de 1.800 pb para os isolados de M. ethiopica, M. hispanica, M. incognita, M. javanica e M. luci, sendo posteriormente digeridos com as enzimas de restrição HinfI, AluI e DraIII, permitindo a diferenciação de M. luci dos demais isolados, exceto de M. ethiopica. Sequências de M. luci foram analisadas, revelando semelhanças com M. ethiopica, não tendo sido possível identificar novos locais de restrição. Marcadores RAPD foram, posteriormente, usados para diferenciar estas duas espécies, produzindo padrões de bandas diferentes. A identificação de NGR é crucial para o desenvolvimento de estratégias sustentáveis para a gestão destes nemátodes. A gestão de NGR é realizada principalmente através do uso de fumigantes químicos, particularmente eficazes, mas a consciencialização relativa à saúde humana e ambiental potenciou o desenvolvimento de estratégias ecológicas alternativas. O efeito de diferentes concentrações de 1,4-NTQ na atração e infetividade ao hospedeiro, e o perfil de expressão dos genes gst e ache de M. luci foram avaliados. Os ensaios revelaram um ligeiro impacto na atração dos jovens do 2º estádio (J2) à raiz, mas mostraram um efeito negativo na infetividade após exposição a concentrações de 2,5, 5 e 10 ppm. Após a exposição de J2 a 10 ppm de 1,4-NTQ, o gene ache não foi expresso e a expressão do gene gst diminuiu. Este estudo contribui para a diferenciação e identificação precisas de NGR, e demonstra o potencial da 1,4-NTQ como um nematodicida natural de baixa concentração para a gestão sustentável de M. luci.

Root knot nematodes (RKN), Meloidogyne spp., are a highly polyphagous group of nematodes distributed worldwide, causing great economic losses. Meloidogyne luci, an emerging species, first described in 2014, and reported in Portugal in 2018 and 2019, was added to the EPPO alert list in 2017. The main objectives of this study were to develop standard molecular protocols for M. luci identification and to investigate the response of M. luci life cycle and gene expression to 1,4-naphthoquinone (1,4-NTQ) in order to develop a potential sustainable management strategy. A Portuguese M. luci isolate was studied by biochemical (esterase phenotype) and molecular characteristics. Accurate identification and differentiation of M. luci was achieved by esterase phenotype (L3). The analysis of mitochondrial DNA region, from COII and 16S rRNA genes, resulted in amplification products of 1,800 bp for the M. ethiopica, M. hispanica, M. incognita, M. javanica and M. luci isolates, being digested with HinfI, AluI and DraIII restriction enzymes, allowing the differentiation of M. luci from the other isolates, except M. ethiopica. Available sequences from M. luci were analysed, revealing huge similarities between M. luci and M. ethiopica sequences, without new restriction sites available. RAPD markers were, subsequently, used to differentiate these two species, producing different band patterns. The accurate identification of RKN is crucial for the development of sustainable strategies for the management of these nematodes. RKN management is mostly performed using chemical fumigants, which are particularly effective, but awareness towards human and environmental health has led to the development of alternative “eco-friendly” strategies. The effect of different concentrations of 1,4-NTQ on root attraction and infectivity, and the gene expression profile of gst and ache genes from M. luci was assessed. The bioassays revealed a slight impact on the second-stage juveniles (J2) root attraction, but showed a negative effect on the J2 infectivity at 2.5, 5 and 10 ppm concentrations. After J2 exposure to 10 ppm 1,4-NTQ concentration, the ache gene lacked expression and gst gene was less expressed. This study depicts a contribution for the RKN accurate differentiation and identification, and also highlights the potential of 1,4-NTQ as a low concentration natural-origin nematicide for the sustainable management of M. luci.