Evaluation of immunotoxicological properties of PCL and PCL/Glucan nanoparticles

Abstract

A nanotecnologia tem sido utilizada para o desenvolvimento de nanomedicamentos afim defacilitar a entrega de agentes terapêuticos. Os nanomedicamentos têm demonstradoextraordinário potencial devido às suas propriedades em melhorar a eficácia terapêutica dofármaco por diversos mecanismos, como o aumento do tempo de retenção em tecidos alvosou permitindo a sua libertação controlada.A Policaprolactona é um poliéster biodegradável que possui biocompatibilidade e baixatoxicidade e também possui a capacidade de se ligar a outros polímeros. Devido a estascaracterísticas tem sido utilizado em várias aplicações. Curdlan é um polímero neutro queconsiste em resíduos de glicose com ligações β-1,3. É extraído da bactéria não-patogénicaAlcaligenes faecalis e possui muitas aplicações baseadas nas suas propriedades físico-químicas eimunomoduladoras. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar in vitro aimunotoxicidade das nanopartículas de PCL/Glucano e PCL, para isso objetivos secundáriosforam definidos.Desenvolver um método de preparação e caracterizar as nanopartículas de PCL/Glucano ePCL como sistemas de entrega de fármacos. Para isso, as NPs de PCL e PCL/Glucano foramproduzidas pelo método de nanoprecipitação. As nanopartículas possuem tamanhossemelhantes, 180 nm para PCL/Glucano e 170 nm para PCL, com potencial zeta quase neutro(-1.59 mV e - 2.54 mV, respectivamente) e apresentaram forma arredondada. Em termos deestabilidade, PCL/Glucano e PCL NPs mostraram grande estabilidade durante as 3 semanasde ensaio à temperatura ambiente. Por outro lado, em meio de cultura de células as NPsapresentaram uma diminuição no seu tamanho em DMEM, porém permanecem similares emRPMI. Em relação à capacidade de adsorver proteínas à sua superficie, entre as proteínastestadas, a mioglobina mostrou melhor eficácia de adsorção.Os testes de imunotoxicidade foram feitos em linha celular de macrófagos, RAW 264.7 e emcélulas primárias humanas (PBMC), a fim de se avaliar a interação das NPs com as células dosistema imunitário assim como a hemocompatibilidade do sistema de entrega através do testeda hemólise. Os dois tipos de nanopartículas mostraram algumas diferenças. Para viabilidadecelular em RAW 264.7, não foram observadas diferenças com significado estatístico entre asNPs, enquanto que nas PBMCs as NPs de PCL/Glucano se mostraram menos citotóxicas queas de PCL, porém foram menos hemocompatíveis quando testadas nos componentessanguíneos.Em relação aos efeitos imunomoduladores, as diferentes NPs não induziram a produção deROS e NO, porém na maior concentração testada, as nanopartículas PCL/Glucanoapresentaram efeito inibitório na produção de NO. Em relação à produção de citocinas, osresultados não são totalmente conclusivos, aparentemente as NPs de PCL induziram umamaior produção de IL-6 que as PCL/Glucano, no entanto, ambas mostraram induçãosemelhante de TNF-α. Finalmente, estudos de internalização mostraram que a presença deglucano nas PCL NPs aumenta a sua capacidade como sistema de entrega de proteínas etambém aumenta a sua internalização em PBMCs.No geral, neste trabalho, nós demonstramos pela primeira vez, a produção e caracterizaçãode nanopartículas de PCL/Glucano. A associação de um segundo polímero (glucano) às PCLNPs resultou em nanopartículas com perfil citotoxicológico e propriedadesimunomodulatórias diferentes do perfil encontrado para as nanopartículas da PCL. Ambas asnanopartículas mostraram uma boa capacidade para adsorver proteínas e fazer a sua entregaàs células do sistema imunitário. Assim sendo, podemos afirmar que as nanopartículas dePCL/Glucano e PCL são nanomedicamentos promissores que podem ser testados na entregade antigéneos e outras proteínas terapêuticas.

Nanotechnology has been used to develop nanomedicines to facilitate the delivery oftherapeutic agents. The nanomedicines have demonstrated extraordinary potential due totheir properties to improve the therapeutic impact of the drug by diverse mechanisms suchas increasing its retention time on target tissues or allowing the controlled release of the drug.Polycaprolactone is a biodegradable polyester that has biocompatibility and low toxicity and acapacity of blending with other polymers. Due to its characteristics, it has been used for alarge set of different applications. Curdlan is a neutral polymer consisting of β-1,3-linkedglucose residues. It is extracted from Alcaligenes faecalis and has many applications in themedical field based on its physicochemical and immunomodulatory properties. Taking this intoaccount, the main objective of this work was to study the in vitro immunotoxicity propertiesof PCL and PCL/Glucan nanoparticles for that secondary objectives were defined.First the development and characterization of PCL/Glucan and PCL nanoparticles as deliverysystems were performed. For that, the PCL NPs were produced according to the optimizedPCL/Glucan NPs through nanoprecipitation technique. The nanoparticles have a similar size,180 nm for PCL/Glucan and 170 nm for PCL, with an almost neutral zeta potentials (-1.59 and- 2.54 mV, respectively) and round shape morphology. In terms of stability, PCL/Glucan andPCL NPs showed great stability up to 3 weeks at room temperature whereas in the cell culturemedium the NPs demonstrate a decrease in size in DMEM however remains similar in RPMI.Regarding their capacity of carrying a model protein, among the model proteins tested,myoglobin showed the higher loading efficacy.Immunotoxicity tests were done in a macrophage cell line, RAW 264.7 and in humanprimary cells (PBMCs) to evaluate the NPs interaction with immune system cells and also thehemocompatibility of the delivery system was assessed by hemolysis. The two nanoparticlesshowed few differences. For cell viability tested in RAW 264.7, no statistical difference wereobserved for both NPs, while in PBMCs the PCL/Glucan NPs revealed to be less cytotoxicthan PCL NPs however less hemocompatible when tested in the blood components.In relation to the immunomodulatory effects, PCL/Glucan and PCL NPs did not induce ROSor NO production, nevertheless in higher concentration the PCL/Glucan showed inhibitoryeffect of the NO production. Regarding cytokines production, the results are not absolutelyconclusive, apparently PCL induced more IL-6 production than PCL/Glucan NPs however,both showed similar ability to induce the TNF-α. Finally, the NPs uptake studies showed that the presence of glucan in the PCL NPs increases its ability as a delivery system for proteinsand also were more efficiently internalized by PBMCs.Overall, in this work, we reported for the first time, the successful production andcharacterization of PCL/Glucan NPs. The association of a second polymer (glucan) to PCLNPs resulted in a blend nanoparticle with different cytotoxicity profile and immunomodulatoryproperties. Both NPs showed to have a good capacity to adsorb therapeutic proteins and todeliver them to immune cells. Therefore, PCL and PCL/Glucan NPs are promisingnanomedicines that can be tested to deliver antigens and other therapeutic proteins.