Renal effects of blueberry juice in a prediabetic rat model induced by hypercaloric diet.

Abstract

A pré-diabetes, também conhecida como hiperglicemia intermédia, é uma condição na qual os indivíduos têm níveis de glucose no sangue mais elevados que o normal, mas não suficientemente altos para serem classificados como diabetes. A pré-diabetes é reconhecida como um fator de risco para o desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), uma condição que está associada ao desenvolvimento de complicações microvasculares sérias, incluindo a nefropatia diabética (DN), que é a principal causa de doença renal terminal. Estilos de vida pouco saudáveis, incluindo dietas hipercalóricas, têm sido reconhecidos como importantes contribuidores da crescente incidência de pré-diabetes. Neste sentido, estratégias terapêuticas precoces, particularmente as baseadas em produtos naturais, poderão contribuir para a prevenção da evolução da lesão renal para estágios mais avançados com consequências graves. A nossa hipótese de trabalho é a de que o sumo de mirtilo (BJ), devido às suas notáveis atividades pré-bióticas, hipoglicémicas, anti-inflamatórias e antioxidantes, possa ser uma estratégia nutracêutica promissora na prevenção da evolução da pré-diabetes, bem como da putativa lesão renal precoce. Tendo isto em conta, esta dissertação apresenta dois objetivos principais: i) caracterizar o grau de lesão renal num estágio de pré-diabetes induzido em ratos através de uma dieta hipercalórica e ii) avaliar os efeitos metabólicos e, em particular, renais da suplementação com BJ a longo prazo. Com vista a atingir estes objetivos, utilizamos um modelo experimental de pré-diabetes induzido por uma dieta hipercalórica [alto teor de sacarose (Hsu) - 35% - e alto teor de gordura (HF) - 60%] em ratos Wistar machos adultos, através da ingestão de Hsu durante 9 semanas, com suplementação de HF por 14 semanas adicionais (grupo HsuHF, n=16). Após 9 semanas, metade dos ratos deste último grupo receberam BJ oralmente (25g/kg de peso corporal, grupo HsuHF+BJ). Os animais controlo (n=8) receberam uma dieta padronizada durante todo o protocolo. Os perfis glicémico, insulinémico e lipídico foram avaliados ao longo do protocolo, bem como a função renal, através de medidas séricas e urinárias de creatinina, ácido úrico e ureia e do cálculo da taxa de filtração glomerular (GFR). A caracterização histológica do rim foi realizada através da coloração com Hematoxicilina e Eosina e a deposição lipídica por coloração de Oil Red O e quantificação de triglicerídeos no soro. Os marcadores inflamatórios séricos e no tecido renal foram avaliados através de ELISA (hs-CRP) e de RT-qPCR e/ou WB (IL-6, TNF-α, iNOS, MMP2, TLR-4 and RAGE). Constatámos que este modelo de pré-diabetes apresenta as principais características deste estágio da doença, com normoglicemia em jejum e hiperglicemia pós-prandial ligeira, intolerância e resistência à insulina, hipertrigliceridemia, bem como aumento de peso. Além disso, os ratos pré-diabéticos apresentaram uma redução significativa da GFR, sem alteração dos marcadores clássicos séricos e urinários da função renal. Histomorfologicamente, os animais sujeitos à dieta hipercalórica apresentaram algumas lesões glomerulares, destacando-se as lesões glomerulares do tipo “crescentes” , que têm vindo a ser associadas a DN. O tratamento com BJ foi capaz de amenizar a intolerância à glucose induzida por uma dieta hipercalórica, a redução de sensibilidade à insulina e a hipertrigliceridemia. Ainda nos ratos do grupo HsuHF+BJ foi verificada uma tendência para a atenuação da redução da GFR encontrada nos animais HsuHF, bem como das lesões glomerulares precoces. Contudo, esta intervenção nutracêutica foi incapaz de travar ou abrandar os crescentes glomerulares, a lipidose renal e o aumento da expressão renal de IL-6, encontrados nos animais do grupo HsuHF. Em conclusão, em contraste com dados anteriormente obtidos pelo grupo de investigação, que sugerem fortemente a existência de efeitos benéficos do BJ a nível da lesão hepática neste modelo de pré-diabetes em rato, esta intervenção nutracêutica com BJ apresentou efeitos renoprotetores muito modestos, apesar da melhoria metabólica verificada pela atenuação da intolerância à glucose, da insensibilidade à insulina e da hipertrigliceridemia.

Prediabetes, also known as intermediate hyperglycaemia, is a condition in which patients have higher blood glucose levels than normal but not higher enough to be classified as overt diabetes. Prediabetes has been recognized as a risk factor for the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM), a condition that is associated with the development of serious microvascular complications, including diabetic nephropathy (DN), the main cause of end-stage renal disease. Unhealthy lifestyle habits, including hypercaloric diets, have been documented as major contributors to the increasing incidence of prediabetes. In this sense, early therapeutic strategies, particularly those based on natural products, could contribute to prevent the evolution of renal impairment to advanced stages with more serious consequences. We hypothesize that blueberry juice (BJ), due to its notable prebiotic, hypoglycemic, anti-inflammatory and antioxidant activities, could be a promising nutraceutical strategy to prevent the progression of prediabetes as well as the putative early renal impairment. Thus, the main goals of this dissertation are twofold: i) to characterize the degree of renal impairment in a stage of prediabetes induced in the rat by an hypercaloric diet and ii) to evaluate the metabolic and particularly the renal effects of long-term BJ supplementation. In order to achieve these goals, we have used an experimental model of prediabetes induced by a hypercaloric diet [high-sucrose (Hsu) - 35% - and high-fat (HF) - 60%] in adult male Wistar rats through the ingestion of Hsu for 9 weeks supplemented by HF for additional 14 weeks (HsuHF group, n=16). After 9 weeks, half of the former rats received BJ orally (25g/kg of body weight, HsuHF+BJ group). Control animals (n=8) received standard diet during the entire protocol. Glycaemic, insulinaemic and lipidic profiles were evaluated throughout the protocol, as well as renal function, using serum and urinary measures of creatinine, uric acid and blood urea nitrogen and calculating the glomerular filtration rate (GFR). Histological characterization of the kidney was performed by H&E and lipid deposition by Oil Red O staining and quantification of serum triglycerides. Serum and renal tissue inflammatory markers were evaluated by ELISA (hs-CRP) and by RT-qPCR and/or WB (IL-6, TNF-α, iNOS, MMP2, TLR-4 and RAGE). We found that this model of prediabetes presents the main features of this stage of the disease, with fasting normoglycaemia and mild postprandial hyperglycaemia, insulin intolerance and resistance, hypertriglyceridaemia, as well as increased body weight. In addition, prediabetic rats displayed a significant reduction of GFR along with unchanged classical serum and urine markers of renal function. Histomorphologically, animals under hypercaloric diet presented some glomerular lesions, being of note the glomerular crescent-like ones, which have been associated with DN. BJ treatment was able to ameliorate hypercaloric diet-induced glucose intolerance, insulin insensitivity and plasma hypertriglyceridaemia. In addition, in the HsuHF+BJ rats there was a trend to alleviate the reduction of GFR found in the HsuHF animals, as well as the early glomerular lesions. However, this nutraceutical intervention was unable to halt or slow down glomerular crescent-like lesions, renal lipidosis and the overexpression of renal IL-6 found in the HsuHF-treated animals.In conclusion, in opposition to previous data from the group strongly suggesting beneficial effects of BJ against liver damage in this rat model of prediabetes, this nutraceutical intervention with BJ presented very modest renoprotective effects, despite the metabolic improvement viewed by the amelioration of glucose intolerance, insulin insensitivity and hypertriglyceridaemia.