Relevância de métodos de PCR quantitativo para a deteção e quantificação de Legionella spp. em amostras ambientais

Abstract

A doença do legionário é uma forma grave e às vezes fatal de uma infeção provocada por Legionella spp. Estas bactérias gram-negativas estão presentes em concentrações baixas em ambientes aquáticos naturais, mas podem-se multiplicar e atingir concentrações muito elevadas em ambientes aquáticos artificiais, de onde podem ser disseminados para humanos. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um método baseado na tecnologia “Droplet digital polymerase chain reaction” (ddPCR) para deteção e quantificação de Legionella spp. e Legionella pneumophila (L. pneumophila) utilizando oligonucleótidos específicos para a amplificação de um fragmento do gene ssrA e de um fragmento do gene mip. Foram assim gerados dados comparativos da deteção e quantificação de Legionella spp. e L. pneumophila, obtidos pelo método de cultivo e pelo método baseado em ddPCR, a partir de amostras ambientais com caraterísticas distintas e/ou de diferentes origens. Assim foram analisadas por ambos os métodos 45 amostras: 9 amostras provenientes de águas processo, 4 de águas termais e 32 de água para consumo humano. O estudo permitiu verificar as potencialidades da utilização da tecnologia ddPCR, como ferramenta de deteção de Legionella, tanto para selecionar amostras negativas como para identificar rapidamente as positivas, o que não é possível com os métodos de cultivo atuais. Adicionalmente forneceu novos conhecimentos na aplicação do ddPCR em amostras ambientais. A relação entre a quantificação expressa em unidades de genoma (UG) de Legionella spp. e/ou L. pneumophila por litro de amostra e o risco associado, necessita no entanto, de dados mais expressivos. A utilização desta metodologia noutras situações, nomeadamente durante a ocorrência de surtos de doença, pode ser importante para definir melhor a relação entre a concentração destas bactérias, determinada desta forma, e o risco associado. Para além disso, a partir dos dados obtidos é possível realizar estudos adicionais para que ensaios baseados em ddPCR possam ser devidamente validados e se possa desenvolver estudos de controlo e de garantia de qualidade de modo a assegurar reprodutibilidade dos resultados entre laboratórios. Em conclusão, o ddPCR permite contagens absolutas e poderá ser uma ferramenta valiosa para testes de rotina e um precioso auxiliar à tomada de decisões em saúde pública. Este método permite uma rápida disponibilização dos resultados, em menos de 24 horas após a recolha das amostras, uma economia de tempo de mais de 8 dias quando comparado com o método de cultivo podendo apoiar os técnicos responsáveis pelas atividades de monitorização e as respetivas entidades reguladores na tomada de decisões.

Legionnaires’ disease is a severe and sometimes fatal form of infection by Legionella spp. These gram-negative bacteria are usually present at low concentrations in natural aquatic environments, but can grow to significant concentrations in man-made water systems, from where they can be disseminated to humans. The aim of the present study was to develop a droplet digital polymerase chain reaction method (ddPCR) for detection and quantification of Legionella spp. and Legionella pneumophila (L. pneumophila). Specific oligonucleotides were used to amplify a fragment of ssrA gene and a fragment of mip gene. Furthermore, comparative data for detection and quantification of Legionella spp. and L. pneumophila using standard culture method and ddPCR from environmental samples with different characteristics and/or from different sources were obtained. A total of 45 water samples were analyzed by both methods: 9 process water samples, 4 thermal water samples and 32 from potable water. The study demonstrated the potential of ddPCR as a useful method for detection of Legionella, to rapidly differentiate negative samples from positive ones, which is not possible with current used culture methods. Additionally, new knowledge in the application of ddPCR technology for microbial analysis from environmental samples was provided. It was not possible to relate risk assessment and types of action and alert from the results, expressed in number of genome units (GU) of Legionella spp. and/or L. pneumophila per liter of sample. The establishment of those relations surely requires more data and the use of this methodology in other situations, namely during outbreaks of disease and public health investigations. The data obtained encourage the realization of additional studies allowing appropriately validation and quality to ensure reproducibility between laboratories. In conclusion, ddPCR techniques allows accurate absolute quantification, and has potential for routine microbial analysis assisting public health decisions. This method significantly reduced the time of analysis, less than 24 hours after sampling, a time saving of more than 8 days compared to the culture method and can enabling the technicians responsible for monitoring activities and the respective regulatory entities to develop a more rapid and effective response.