Methylphenidate-induced alterations in astrocytes: A comprehensive characterization

Abstract

Methylphenidate (MPH) is the first-line drug of choice for the treatment of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), a highly prevalent condition in children that may also persist into adulthood. ADHD diagnosis, which is only based on the clinical history of the patient, is rapidly increasing, along with MPH prescription. MPH non-medical use is also a common practice mainly among students with intent to improve their cognitive performance. This represents a critical problem, intensified by the fact that there is poor knowledge regarding the chronic and long-term effects of MPH treatment on the brain, both under ADHD and healthy conditions. In addition, the neurobiological effects of MPH have not yet been fully characterized, particularly in glial cells, such as astrocytes, that play essential roles in healthy and diseased brain. Thus, the present work aimed to characterize the direct effects of MPH on astrocytes, and also to investigate the impact of MPH chronic exposure in control and ADHD animal models, simulating MPH non-therapeutic and therapeutic use, respectively. To achieve these goals, primary cultures of rat cortical astrocytes and both Wistar-Kyoto (WKY) and Spontaneously Hypertensive (SHR) rats treated with a clinically relevant dose of MPH were used as in vitro and animal models, respectively. The present study showed that direct MPH treatment did not induce astrogliosis, but promoted apoptotic cell death in a concentration-dependent manner. Moreover, MPH was able to induce reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) intracellular production by astrocytes, as well as an increase of inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein levels. In addition, the nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway was activated by MPH. Regarding animal studies, SHR animals showed a tendency to an increment of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and iNOS levels in the hippocampus comparing to control animals, suggesting that this ADHD model presents a basal inflammatory status. Curiously, MPH treatment led to a significant increase of both GFAP and iNOS protein levels in control animals, whereas in SHR rats there was a slight beneficial effect. Regarding lipid peroxidation, MPH treatment decreased such levels only in ADHD animals both in the prefrontal cortex (PFC) and hippocampus. Interestingly, the ADHD animal model presented, particularly in the hippocampus, a basal lower antioxidant capacity compared to control rats, which MPH treatment tended to increase. Still in the hippocampus, MPH chronic treatment decreased the antioxidant capacity of controls (WKY-rats). In conclusion, MPH induced a moderate direct effect in astrocytes particularly related with oxidative and nitrosative stress. Nevertheless, in a more complex context using animal studies, the observed responses related to astrogliosis, oxidative/nitrosative stress and antioxidant capacity, demonstrate that MPH non-therapeutic use has detrimental outcomes, while MPH therapeutic use is beneficial under ADHD conditions.This work unveils for the first time some of the direct effects of MPH on astrocytes, and improved our knowledge about the central effects of both therapeutic and misuse of MPH.

O metilfenidato (MTF) é o fármaco mais prescrito no tratamento de primeira linha da perturbação de hiperatividade/défice de atenção (PHDA), condição com grande prevalência nas crianças e que pode também persistir na idade adulta. O diagnóstico de PHDA, feito apenas com base no historial clínico do paciente, está a aumentar, a par com a prescrição de MTF. O uso não-terapêutico de MTF é uma prática comum principalmente entre estudantes que procuram melhorar a sua performance cognitiva. Isto representa um problema, que é intensificado pelo escasso conhecimento atual sobre os efeitos crónicos e a longo prazo do tratamento com MTF, em particular no cérebro, tanto em condições de PHDA como fisiológicas. Por outro lado, os efeitos neurobiológicos do MTF também não são bem conhecidos, em especial nas células da glia, como os astrócitos, cuja função cerebral é fundamental em condições saudáveis e de doença. Assim, este trabalho teve como principais objetivos estudar os efeitos diretos do MTF nos astrócitos, e o impacto do seu consumo crónico num modelo animal de PHDA e controlo, simulando desta forma o uso terapêutico e não-terapêutico do MTF, respetivamente. Para atingir estes objetivos, foram usadas culturas primárias de astrócitos corticais de rato como modelo in vitro, bem como dois modelos animais, Wistar-Kyoto (WKY) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR), tratados com uma dose clinicamente relevante de MTF.Este estudo demonstrou que o tratamento direto dos astrócitos com MTF não induziu astrogliose, mas provocou morte celular por apoptose de forma dependente da concentração. Ainda, esta droga demonstrou ser capaz de induzir a produção intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROS) e de óxido nítrico (NO) nos astrócitos, bem como um aumento nos níveis de proteína da sintase do óxido nítrico induzível (iNOS). Para além disso, a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB) foi ativada pelo MTF. Relativamente aos estudos em animais, os ratos SHR não tratados apresentaram uma tendência para níveis aumentados da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e de iNOS no hipocampo, comparando com os respetivos animais controlo, o que sugere que este modelo de PHDA apresenta um estado de inflamação basal. Curiosamente, o tratamento com MTF levou a um aumento significativo dos níveis proteicos de GFAP e iNOS em animais controlo, enquanto nos animais SHR foi verificado um leve efeito benéfico. Relativamente à peroxidação lipídica, esta foi diminuída pelo tratamento com MTF, apenas no modelo animal de PHDA, tanto no hipocampo como no córtex pré-frontal. O modelo animal de PHDA apresentou ainda uma capacidade antioxidante basal reduzida no hipocampo, a qual sofreu uma tendência para ser aumentada pelo tratamento com MTF. Também no hipocampo, o tratamento com MTF diminuiu a capacidade antioxidante dos ratos WKY. Em conclusão, o MTF induziu um efeito direto moderado nos astrócitos, especialmente relacionado com stress oxidativo e nitrosativo. Não obstante, num contexto mais complexo como os estudos em animais, as respostas observadas, associadas à astrogliose, stress oxidativo/nitrosativo e capacidade antioxidante, evidenciam que o uso não-terapêutico do MTF tem um efeito prejudicial, enquanto o seu uso terapêutico, em condições de PHDA, é benéfico. Este trabalho descreve pela primeira vez alguns dos efeitos diretos do MTF nos astrócitos, e enriquece o nosso conhecimento sobre os efeitos cerebrais tanto do uso terapêutico como do uso não terapêutico do MTF.