Microglia Morphology and Behavior upon Testosterone Administration of Females Prenatally Exposed to Dexamethasone

Abstract

Neuropsychiatric disorders are the most common mental illnesses in the world and present a sex dimorphism in prevalence, symptoms and treatment. Sex differences arise since neurodevelopment in which males experience a peak in testosterone that is responsible for brain masculinization, meaning there is an organization in density, connectivity and morphology of cells, including microglia, in several brain regions. This remodeling of the brain will have long term consequences in behavior.Microglia are the immune cells of the central nervous system that are responsible for sculpting neuronal circuits during neurodevelopment, but also ensuring the homeostasis through screening the parenchyma with their highly dynamic ramifications. The morphology and function of microglia are under the influence of the A2A receptor (A2AR), which blockade is known to have anxiolytic effects. Our group has demonstrated that upon prenatal stress, induced by dexamethasone (DEX) exposure on gestational days 18 and 19, males and females have an anxious-like behavior at adulthood (postnatal day 90 – PND90) and present a sex-specific remodeling of microglia morphology in the prefrontal cortex (PFC), a brain region essential for emotional regulation. Furthermore, when these animals are treated with an anxiolytic (SCH58261, an antagonist of the A2AR), only male behavior and microglia morphology return to physiological conditions. The sex dimorphism observed in this study lead to the hypothesis that testosterone could have a protective effect in males.The aim of this thesis is to assess A2AR ability to retrieve microglia morphology and behavior upon brain masculinization of females prenatally exposed to DEX. In other words, through female masculinization (by mimicking the peak of testosterone in males on PND0), we aim to evaluate if testosterone has a permissive effect for the action of the antagonist of the A2AR in females exposed to DEX. Neurodevelopmental behavior is assessed between PND5 and 17, through a battery of tests. Regarding sex differences, males and females have a similar performance in physiology therefore, neonatal administration of testosterone did not have major effects on behavior. When DEX is administered, no effect is observed on behavior however, females have reduced strength and an anticipation of eye opening day. In DEX groups, no sex dimorphism is observed, but testosterone increases strength and delays eye opening day in females. Furthermore, testosterone induces a delay in cliff avoidance, which is reverted by DEX exposure. Previous results from our group show that males and females prenatally exposed to DEX have changes in neurodevelopmental tests performance and anxious-like behavior at adulthood. In this cohort of animals DEX did not induce changes in the progeny performance in neurodevelopmental tests nor an anxious-like behavior, suggesting that alterations in neurodevelopmental behavior might be used as predictive factors for the development of neuropsychiatric disorders.When DEX females are neonatally masculinized with testosterone, no anxious-like behavior is observed with or without SCH58261 administration, suggesting a protective effect of testosterone in behavior. However, when we analyze masculinized females’ microglia from the PFC at adulthood, we observe testosterone was not able to revert DEX-induced atrophy even with anxiolytic treatment. Furthermore, when comparing CTRL+T and DEX+T females we observe no association between behavior and microglia morphology. These results suggest that testosterone was not permissive to the action of SCH58261, and also that testosterone has a mechanism to modulate behavior that is independent of microglia morphology. Neonatal testosterone administration did not induce changes in peripheral levels of corticosterone at adulthood. Hence, when evaluating testosterone levels from serum we observe a tendency for SCH58261 to reduce levels of this hormone in CTRL+T females, but when this anxiolytic is administered in DEX+T females the pattern of action changes, and there is a tendency for an increase in testosterone levels. These results lead us to suggest that the blockage of A2AR modulates testosterone levels, peripherally. In vitro studies were conducted aiming to unravel a possible interaction between androgen receptors (AR) and A2AR specifically in microglial cells. We show that testosterone has an impact on A2AR density that is dependent of time of exposure and concentration. On the other hand, activating or blocking A2AR does not have an impact on AR density. This work highlights the potential anxiolytic properties of testosterone, and also its role in modulating A2AR, namely in microglia, which could account for the sex dimorphism observed in microglia morphology and in behavior. Nonetheless, additional studies are needed to further unveil the possible protective and organizational effect of testosterone in this model of chronic anxiety.

As doenças neuropsiquiátricas, são as enfermidades mentais mais comuns no mundo e apresentam dimorfismo de sexo na sua prevalência, sintomatologia e tratamento. Estas diferenças iniciam-se no neurodesenvolvimento, pois os machos têm um pico de testosterona que induz masculinização cerebral, ou seja, reorganização na densidade, conectividade e morfologia das células, como a microglia, em várias regiões cerebrais. A remodelação cerebral irá ter repercussões a longo-prazo no comportamento. A microglia é a célula imune do sistema nervoso central que é responsável por esculpir os circuitos neuronais durante o desenvolvimento cerebral, mas também por manter a homeostasia no parênquima, através das suas ramificações altamente dinâmicas. A morfologia e função da microglia estão sob a influência dos recetores A2A (A2AR), cujo bloqueio foi demonstrado como tendo efeito ansiolítico.O nosso grupo mostrou que numa situação de stress pré-natal, induzido por dexametasona (DEX) nos dias gestacionais 18 e 19, machos e fêmeas têm um comportamento do tipo ansioso na idade adulta (dia pós-natal 90 – PND90) e remodelação da morfologia da microglia dependente do sexo no córtex pré-frontal (PFC), uma região cerebral essencial para a regulação emocional. Adicionalmente, quando os descendentes são tratados com um ansiolítico (SCH58261; antagonista dos A2AR), apenas o comportamento e a morfologia da microglia dos machos regressa à fisiologia. O dimorfismo de sexo visto neste estudo levou à hipótese de que a testosterona poderia ter um efeito protetor nos machos.O objetivo deste estudo é perceber a capacidade dos A2AR recuperarem a morfologia da microglia e comportamento após masculinização cerebral de fêmeas prenatalmente expostas a DEX. Noutras palavras, através da masculinização feminina (mimetização do pico de testosterona que ocorre a PND0 em machos), objetivámos avaliar se a testosterona tem um efeito permissivo para a ação do antagonista dos A2AR em fêmeas expostas a DEX. O comportamento no neurodesenvolvimento foi estudado entre PND5 e 17 através de uma bateria de testes. Relativamente às diferenças de sexo, machos e fêmeas têm uma performance semelhante fisiologicamente, como tal a administração neonatal de testosterona não teve efeitos major no comportamento. A exposição a DEX não teve efeito no comportamento, contudo, as fêmeas têm uma redução na força e uma antecipação do dia de abertura do olho. Nos grupos DEX, não se observou dimorfismo de sexo, mas a testosterona aumentou a força e atrasou o dia de abertura do olho em fêmeas. Além disso, a testosterona induziu um atraso na aversão ao precipício, que foi revertida pela DEX. Estudos prévios do grupo mostraram que machos e fêmeas prenatalmente expostos a DEX têm mudanças no comportamento do neurodesenvolvimento e um comportamento do tipo ansioso a PND90. Nestes animais a DEX não induziu mudanças comportamentais em nenhuma idade, sugerindo que as alterações no comportamento do neurodesenvolvimento poderão ser usadas como fatores preditivos para o desenvolvimento de doenças psiquiátricas.Quando as fêmeas DEX são masculinizadas neonatalmente com testosterona, não se observa comportamento do tipo ansioso, com ou sem administração de SCH58261, sugerindo um efeito protetor da testosterona no comportamento. No entanto, quando analisamos a microglia do PFC de fêmeas a PND90, observamos que a testosterona não é capaz de reverter a atrofia induzida pela DEX mesmo com a administração do ansiolítico. Adicionalmente, quando comparamos as fêmeas CTRL+T e DEX+T vimos que não há associação entre o comportamento e a morfologia da microglia. Estes resultados sugerem que a testosterona não teve um efeito permissivo à ação do SCH58261, mas também que o mecanismo de ação da testosterona no comportamento é independente da morfologia da microglia.A administração neonatal de testosterona não induziu alterações nos níveis periféricos de corticosterona a PND90. Todavia, quando avaliamos os níveis de testosterona vemos uma tendência para o SCH58261 reduzir os níveis desta hormona em fêmeas CTRL+T, mas em fêmeas DEX+T o ansiolítico induz uma tendência para o aumento de testosterona. Estes resultados levam a sugerir que o bloqueio dos A2AR modula os níveis de testosterona periféricos. Estudos in vitro tiveram o objetivo de perceber a possível interação entre recetores de androgénios (AR) e A2AR na microglia. Mostramos que a testosterona modula a densidade dos A2AR, de modo dependente do tempo de exposição e da concentração. Por outro lado, a ativação ou bloqueio dos A2AR não teve impacto na densidade dos AR. Este trabalho mostra as propriedades ansiolíticas da testosterona, mas também o seu papel modulador dos A2AR, nomeadamente na microglia, o que poderá explicar o dimorfismo de sexo na morfologia da microglia e comportamento. No entanto, estudos adicionais são necessários para melhor perceber o possível efeito protetor e organizacional da testosterona neste modelo de ansiedade crónica.