Determinação post mortem de etanol em diferentes tipos de amostras biológicas: desenvolvimento e validação de uma metodologia analítica por HS-GC-FID em contexto forense

Abstract

Embora o procedimento de ensaio para a quantificação do etanol seja um processo relativamente simples, segundo a literatura existem algumas dúvidas relativamente à origem do etanol determinado post mortem, uma vez que há a possibilidade de formação e eliminação post mortem desta substância, o que pode levar a uma incorreta interpretação dos resultados analíticos. Assim, como referido na literatura, é recomendado analisar para além do sangue outras matrizes biológicas. O uso de diferentes tipos de matrizes biológicas tem como intuito corroborar os resultados obtidos através da análise no sangue. O presente estudo propõe a análise simultânea do humor vítreo e da urina como matrizes biológicas complementares na determinação e quantificação de etanol em casos post mortem.O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento e a validação de uma metodologia analítica rápida e fiável para a deteção, identificação e quantificação de etanol simultaneamente em diferentes tipos de matrizes biológicas (humor vítreo, sangue e urina) em situações post mortem.O presente trabalho experimental englobou duas partes distintas. Numa primeira parte, procedeu-se à otimização de um método cromatográfico, já existente no Serviço de Química e Toxicologia Forenses da Delegação do Centro (SQTF-DC) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses (INMLCF, I.P.), para a determinação de etanol em amostras de sangue num cromatógrafo de gases Varian 450-GC com detetor de ionização de chama, acoplado a um injetor de headspace (HS-GC-FID). Para além da otimização das condições cromatográficas, houve a necessidade de alterar o padrão interno usualmente utilizado, o n-propanol, pelo acetonitrilo. A preparação dos vials foi realizada por meio da diluição de 100 μL da amostra de interesse em 1 mL de padrão interno (acetonitrilo a 0,1 g/L). Durante a análise cromatográfica foram utilizadas duas colunas capilares (VF-5ms e VF-624ms) com diferentes polaridades, de forma a garantir o cumprimento dos critérios de identificação recomendados para este tipo de análise, ou seja, que todas as substâncias em estudo fossem devidamente identificadas e distinguidas das restantes. Na segunda parte, efetuou-se a validação da metodologia analítica desenvolvida para a deteção, identificação e quantificação de etanol post mortem nas diferentes matrizes biológicas.O etanol foi estudado numa gama de trabalho de 0,10-5,00 g/L e foram avaliados os parâmetros da seletividade, interferentes, modelo de calibração e linearidade, limiares analíticos, precisão, exatidão, arrastamento e estabilidade segundo a norma do Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX). A metodologia desenvolvida apresentou como principal vantagem a redução do intervalo de tempo de análise, permitindo a eluição do analito de interesse e do padrão interno em apenas 3 minutos. Esta metodologia demonstrou ser seletiva e linear na gama de trabalho estudada, com coeficientes de determinação superiores a 0,99. Relativamente aos limiares analíticos, o limite de deteção foi de 0,01 g/L e o limite de quantificação de 0,04 g/L. A metodologia também apresentou baixos níveis de CV para a precisão intermédia e para a repetibilidade e taxas de recuperação próximas de 100% o que demonstra ser uma metodologia precisa e exata. Todos os parâmetros de validação estudados apresentaram resultados considerados satisfatórios segundo a norma SWGTOX.

Although the analysis procedure for the quantification of ethanol is a relatively simple process, according to the literature there are some doubts regarding the origin of the ethanol determined post mortem, since there is the possibility of formation and post mortem elimination of this substance, which can lead to an incorrect interpretation of the analytical results. Thus, as mentioned in the literature, it is recommended to analyze other biological matrices in addition to blood. The use of different types of alternative biological matrices is intended to corroborate the results obtained through blood analysis. The present study proposes the simultaneous analysis of vitreous humor and urine as complementary biological matrices in the determination and quantification of ethanol in post mortem cases.The objective of this study was the development and validation of a fast and reliable analytical methodology for the detection, identification and quantification of ethanol simultaneously in different types of biological matrices (vitreous humor, blood and urine) in post mortem situations.The present experimental work comprised two distinct parts. In the first part, we proceeded to the optimization of a chromatographic method, already existing in the Forensic Chemistry and Toxicology Service of the Center Delegation (SQTF-DC) of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences (INMLCF, I.P.), for the determination of ethanol in blood samples in a Varian 450-GC gas chromatograph with flame ionization detector, coupled to a headspace injector (HS-GC-FID). In addition to the optimization of chromatographic conditions, there was a need to change the internal standard usually used, n-propanol, by acetonitrile. The preparation of vials was performed by diluting 100 μL of the sample of interest in 1 mL of internal standard (acetonitrile at 0.1 g/L). During the chromatographic analysis, two capillary columns (VF-5ms and VF-624ms) with different polarities were used, in order to ensure compliance with the recommended identification criteria for this type of analysis, that is, that all substances under study were properly identified and distinguished from the rest. In the second part, the analytical methodology developed for the detection, identification and quantification of post mortem ethanol in the different biological matrices was validated.Ethanol was studied in a working range of 0.10-5.00 g/L and the parameters of selectivity, interferents, calibration and linearity model, analytical thresholds, precision, accuracy, entrainment and stability were evaluated according to the Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX). The developed methodology presented as main advantage the reduction of the analysis time interval, allowing the elution of the analyte of interest and the internal standard in just 3 minutes. This methodology proved to be selective and linear in the studied work range, with determination coefficients greater than 0.99. Regarding the analytical thresholds, the detection limit was 0.01 g/L and the quantification limit was 0.04 g/L. The methodology also showed low levels of CV for intermediate precision and for repeatability and recovery rates close to 100%, which proves to be a precise and exact methodology. All validation parameters studied showed results considered satisfactory according to the SWGTOX standard.