BIOCOMPATIBLE NANOPARTICLES TO MODULATE CELL ACTIVITY

Abstract

RNA-based medicines have distinct advantages in comparison to conventional drug such as small molecules or other biomolecules in terms of specificity, potency, number of accessible targets, manufacturing, among others. However, several obstacles need to be addressed before the clinical translation of RNA-based therapeutics such as targeting and intracellular delivery. The main objective of this thesis was the development of biocompatible light-triggerable nanoparticle libraries to improve cell targeting and intracellular delivery of RNA-based medicines, for both in vitro and in vivo applications. The two nanoparticle libraries (each one of them were obtained from poly(amido amine) polymers) were synthesized by high-throughput strategies via Michael-type addition. In one of the libraries (160 NP formulations), the polymers were sensitive to light because they incorporated in their backbone a photo-cleavable linker (PCL) while, in the other (110 NP formulations), the polymer backbone was not sensitive to light but was modified with a pendent photo-cleavable molecule. In both cases, the polymers were precipitated in aqueous solution to form nanoparticles which were then complexed with siRNA or miRNA molecules. NP dissociate at different rates once activated by UV or a blue laser. A significant number of NPs showed more than 75% decrease in concentration after 10 min of light activation. In a High Content Screening, the NP library was screened for a fast transfecting carrier (with less than one hour of cell-material contact) in a model system (anti-GFP siRNA), that cause higher gene silencing than a commercial agent with boosted efficacy using light activation. More than a third of light-triggered NPs was found with increased gene silencing efficacy (up to 500%) in comparison to commercial transfection agent (Lipofectamine RNAiMAX) without compromised cell viability. Several candidates were further characterised in secondary tests regarding their specificity to skin cells (with some NPs that were more internalised by a specific type of cell than others) and endolysosomal escape. Functional studies before and after light activation with therapeutic relevant siRNA and miRNA prove applicability of the carriers for in vivo experimentation. Moreover, we have confirmed the advantages of one of the candidate formulations in a wound healing animal model, for the delivery of a recently identified skin regenerative miRNA. This thesis describes a powerful platform with the first light-activatable nanoparticle library with remote activation and efficient in vivo non-coding RNA delivery in wound healing. The results presented here are an exciting first step towards the translation of light-triggerable polymeric carriers for RNA-based therapeutics delivery.

Resumo: As terapias baseadas em moléculas de RNA apresentam vantagens quando comparadas com medicamentos convencionais, tais como pequenas moléculas ou outras biomoléculas, em termos de especificidade, potência, número de alvos acessíveis, fabricação, entre outros. No entanto, vários obstáculos precisam de ser ultrapassados antes da translação clínica destas terapias baseadas em RNA, tais como a entrega direcionada e a entrega intracelular. O principal objetivo desta tese foi o desenvolvimento de bibliotecas de nanopartículas (NPs) biocompatíveis e responsivas à luz para aumentar a eficácia da entrega intracelular de moléculas de RNA, para aplicações in vitro e in vivo. As duas bibliotecas de nanopartículas (cada uma delas foi obtida a partir de polímeros de poli (amido amina)) foram sintetizadas através de estratégias de alto rendimento via reação de adição do tipo Michael. Numa das bibliotecas (160 formulações de NPs), os polímeros são sensíveis à luz uma vez que foi incorporado na sua estrutura um grupo foto-clivável (PCL), enquanto que na outra biblioteca (110 formulações de NPs), a estrutura do polímero não era sensível à luz, mas foi modificado com uma molécula pendente foto-clivável. Nas duas bibliotecas, os polímeros foram precipitados numa solução aquosa para formar nanopartículas, sendo posteriormente complexadas com moléculas de siRNA ou miRNA. Uma vez irradiadas com luz UV ou um laser azul, as NPs desintegram-se e libertam o siRNA ou o miRNA. Um número significativo de NPs mostrou uma diminuição na concentração superior a 75% após 10 min de ativação com luz. Numa triagem de alto conteúdo, as bibliotecas de NPs foram testadas para encontrar uma formulação que tivesse uma transfecção rápida (com menos de uma hora de contato célula-material) num sistema modelo (siRNA anti-GFP), causando um silenciamento eficaz do gene, quando comparado com um agente comercial. Mais de um terço das NPs irradiadas com luz mostraram uma eficácia superior do silenciamento do gene (máximo até 500%) em comparação com o agente de transfecção comercial (Lipofectamine RNAiMAX), sem com isso comprometer a viabilidade celular. As formulações mais eficazes foram também caracterizadas em testes secundários quanto à sua especificidade para células da pele (com algumas NPs que foram mais internalizados por um tipo específico de célula do que outros) e escape endolisossomal. Estudos funcionais, antes e depois da ativação de luz, usando siRNA e miRNA com relevância terapêutica comprovam a aplicabilidade das formulações para experimentação in vivo. Além disso, confirmamos as vantagens de uma das melhores formulações em um modelo animal de cicatrização de feridas, para a entrega de um miRNA regenerativo de pele. Esta tese descreve pela primeira vez uma biblioteca de nanopartículas ativáveis remotamente por luz para a entrega eficiente de RNA não codificante in vivo na cicatrização de feridas. Os resultados aqui apresentados demonstram um passo promissor para a translação de formulações poliméricas foto-ativáveis pela luz na entrega de terapias baseadas em RNA.

Kurzzusammenfassung: RNA-basierte Arzneimittel haben im Vergleich zu herkömmlichen Arzneimitteln, wie kleinen Molekülen oder anderen Biomolekülen, deutliche Vorteile. Unter anderem hinsichtlich der Spezifität, Wirksamkeit, Anzahl zugänglicher Ziele und Herstellung. Vor der klinischen Übersetzung von RNA-basierten Therapeutika müssen jedoch einige Hindernisse, wie gezielte Arzneimittelabgabe (Targeting) und intrazelluläre Verabreichung, überwunden werden. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Bibliothek biokompatibler lichtaktivierbarer Nanopartikel (NP) zur Verbesserung des Zell-Targetings und der intrazellulären Abgabe von RNA-basierten Arzneimitteln für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen. Die entstandenen zwei Nanopartikelbibliotheken (jede bestehend aus Poly(amido amin)-Polymeren) wurden durch Hochdurchsatzstrategien unter Verwendung von Michael-Addition synthetisiert. In einer der Bibliotheken (160 NP-Formulierungen) wurden durch den Einbau eines photospaltbaren Linkers (PCL) in das Grundgerüst, lichtempfindliche Polymere hergestellt. Für die Andere Bibliothek (110 NP Formulierungen) wurde das (nicht lichtempfindliche) Polymer mit einem photospaltbaren Molekül (Photo-Antenne) modifiziert. In beiden Fällen wurden die Polymere in wässriger Lösung ausgefällt um Nanopartikel zu bilden, die dann mit siRNA- oder miRNA-Molekülen komplexiert wurden. Die NP dissoziieren mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten, sobald sie durch UV- oder einen blauen Laser aktiviert werden. Eine signifikante Anzahl von NP zeigte nach 10 Minuten Lichtaktivierung eine Konzentrationsabnahme von mehr als 75%. In einem High Content Screening wurde die NP-Bibliothek in einem Modellsystem (Anti-GFP-siRNA) auf einen schnell transfizierenden Träger (mit weniger als einer Stunde Zellmaterialkontakt) gescreent, der eine höhere Gen-Stummschaltung (Gen-Silencing) mit verstärkter Wirksamkeit durch Lichtaktivierung erzielt als ein kommerzielles Mittel. Mehr als ein Drittel der durch Licht aktivierten NP wurde mit einer erhöhten Gen-Silencing-Wirksamkeit (bis zu 500%) im Vergleich zu einem kommerziellen Transfektionsmittel (Lipofectamin RNAiMAX) ohne Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der Zellen gefunden. Mehrere Kandidaten wurden in Sekundärtests hinsichtlich ihrer Spezifität für Hautzellen (mit einigen NP, die von einem bestimmten Zelltyp stärker internalisiert wurden als andere) und ihrem endolysosomalen Austritt weiter charakterisiert. Funktionsstudien vor und nach Lichtaktivierung mit therapeutisch relevanter siRNA und miRNA belegen die Anwendbarkeit der Träger für In-vivo-Experimente. Darüber hinaus wurden die Vorteile einer der Kandidatenformulierungen in einem Tiermodell für Wundheilungsstudien, hinsichtlich der Abgabe einer kürzlich identifizierten hautregenerativen miRNA, bestätigt. Diese Arbeit beschreibt eine leistungsstarke Plattform mit der ersten lichtaktivierbaren Nanopartikelbibliothek mit Fernaktivierung und effizienter in vivo Abgabe nicht-kodierender RNA bei der Wundheilung. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind ein aufregender erster Schritt zur Translation lichtauslösbarer polymerer Träger für die Abgabe von RNA-basierten Therapeutika.