Regulation of apoptosis and differentiation by P53 in human embryonic stem cells

Abstract

Human embryonic stem cells (hESC) display pluripotency and unlimited self-renewal while retaining a normal karyotype, suggesting they possess mechanisms to minimize the consequences of DNA damage. The molecular mechanisms controlling DNA-damage induced apoptosis of hESC are poorly understood. This study investigates the role of p53 in DNA damaged-induced apoptosis and cell differentiation. hESC are extremely sensitive to spontaneous apoptosis, as well as gamma irradiation-, hydrogen peroxide- and etoposideinduced apoptosis. Indeed, early passage hESC appear to be far more sensitive to etoposideinduced apoptosis than adapted hESC and cancer cell lines. The data further show that undifferentiated hESC that express Oct4 are much more sensitive to etoposide-induced apoptosis than their more differentiated progeny. It is shown that p53 is constitutively expressed at high levels in the cytoplasm of hESC. Etoposide treatment results in rapid and extensive induction of apoptosis and leads to a further increase in p53 and PUMA expression as well as Bax processing. p53 both translocates to the nucleus and associates with the mitochondria, accompanied by colocalisation of Bax with Mcl1. hESC stably transduced with p53 shRNA, display 80 % reduction of endogenous p53 and exhibit an 80 % reduction in etoposide-induced apoptosis accompanied by constitutive downregulation of Bax and an attenuated upregulation of PUMA. Furthermore, gene profile analysis of untreated GFP and p53 shRNA transduced hESC shows that p53 controls a set of genes under normal conditions. Around 70 % of these genes contain p53 responsive elements. No significant differences were observed between cell cycle entry of GFP and p53 shRNA transduced cell lines or distribution of phases of cell cycle and the karyotypes of both cell lines were found to be normal. p53 had a small but reproducible effect in inhibiting spontaneous differentiation. Preliminary studies to address the role of p53 in differentiation of hESC revealed a slight resistance of p53 shRNA transduced cell lines to BMP4-induced differentiation and the opposite was observed in relation to Activin A treatment. Furthermore, these cells formed teratomas (with representative tissues of all three germ layers) when implanted beneath the testis capsule of SCID mice that exhibited a higher proportion of immature neural tissue compared to control cells, suggesting that these cells are more prone to undergo differentiation to the neural lineage, or mature more slowly. This study demonstrates that p53 plays a role in differentiation, is required for etoposide-induced apoptosis of hESC and reveals, at least in part, the molecular mechanism of DNA damage-induced apoptosis in hESC.

As células estaminais embrionárias humanas (hESC) possuem características de pluripotência e capacidade ilimitada de auto-renovação, mantendo ao mesmo tempo um cariótipo normal, o que sugere que estas possuem mecanismos que minimizam as consequências de danos no ADN. Os mecanismos moleculares que controlam a apoptose das hESC induzida por danos no ADN são pouco compreendidos. Este estudo investiga o papel do p53 na apoptose induzida por agentes que causam danos no ADN e na diferenciação celular. As hESC são extremamente sensíveis à apoptose espontânea, como também à induzida por radiação gama, peróxido de hidrogénio e etopósido. De facto, as hESC com poucas passagens são muito mais sensíveis à apoptose induzida por etopósido do que hESC adaptadas e linhas celulares cancerígenas. Os dados deste estudo também demostram que as hESC indiferenciadas que expressam Oct4 são mais sensíveis à apoptose induzida pelo etopósido do que a sua progenia diferenciada. O p53 é constitutivamente expresso em níveis elevados no citoplasma das hESC. O tratamento com etopósido leva a uma rápida indução da apoptose e aumento da expressão do p53 e do PUMA, bem como ao processamento do Bax. O p53 transloca para o núcleo e associa-se com a mitocôndria e isto é acompanhado com a co-localização do Bax com o Mcl1. As hESC estavelmente expressam shRNA desenhado para diminuir a expressão do p53, possuem uma reducção em 80 % do p53 endógeno e exibem também uma reducção na apoptose induzida pelo etoposide, acompanhada por uma diminuição nos níveis do Bax e por uma atenuação no aumento dos níveis do PUMA. A análise do perfil da expressão de genes de hESC que expressam shRNA para reduzir a expressão do p53 e GFP mostra que o p53 controla um conjunto de genes em condições normais. Cerca de 70 % destes genes contêm nos seus promotores locais de ligação para o p53. Não foram observadas diferenças significativas na distribuição das fases do ciclo celular das hESC que expressam shRNA para reduzir a expressão do p53 e GFP e os cariótipos destas células são normais. O p53 tem um pequeno, mas reprodutivél efeito na inibição da differenciação espontânea. Estudos preliminares para investigar o papel do p53 na diferenciação das hESC revelaram uma pequena resistência das células que expressam shRNA para diminuir os níveis do p53 à diferenciação induzida pelo BMP4, sendo o oposto observado em relação ao tratamento com Activina A. Estas células formam teratomas (com tecidos representativos das três camadas germinativas) quando implantadas na cápsula de murganhos immunodeprimidos SCID que exibem uma maior proporção de tecido neural imaturo quando comparadas com teratomas formados pelas células controlo, o que sugere que elas preferencialmente se diferenciam numa linhagem neural ou que o seu processo de maturação é mais lento. Este estudo demonstra que nas hESC, o p53 desempenha um papel na diferenciação celular, é necessário para a apoptose induzida pelo etopósido e revela em parte o mecanismo molecular que controla a apoptose induzida por danos no ADN das hESC.