Optimizing the scale up biochemical platform biorefinery for lactic acid production from lignocellulosic biomass

Abstract

Lignocellulosic biomass, such as forest and agriculture residues or dedicated energy crops, is a promising renewable feedstock for the production of advanced biofuels and chemical building blocks. Lactic acid (LA) has been identified as one with high potential, playing an essential role in industrial applications ranging from the food industry to life-sciences. Moreover, LA is widely used for producing green, biodegradable and biocompatible polylactic acid polymers (PLA). In order to develop an efficient process for the production of LA from lignocellulosic biomass, complementary to the selection of the biomass, process optimization must be carried out. For this, three main operations have to be considered - (1) biomass pretreatment, (2) enzymatic saccharification to obtain fermentable sugar by cellulases and (3) the fermentation of sugars by suitable microorganisms to lactic acid. The selection of the raw material as well as the development of the main process operations are the focus of this work.

The selection of the raw material was focused on evaluating two mixtures of lignocellulosic biomass (M1-4 and M2-3), forest ecosystems and biological resources from marginal land, in order to co-produce oligosaccharides, solid fuel and glucose under a biorefinery concept. The selection of mixtures was based on different criteria, namely, territorial distribution, fire risk during summer months and total sugar content. The two mixtures were submitted to autohydrolysis pretreatment under non-isothermal conditions (in the range of 190 ºC - 240 ºC corresponding to severity of 3.71 to 4.82). Both mixtures were compared in terms of fractionation (cellulose and lignin recoveries and hemicellulose solubilization) and for enzymatic susceptibility of cellulose. The highest xylan recoveries (62 and 69 %), as xylose and xylooligosaccharides, were achieved for both mixtures in the liquid phase at 206 ºC. Moreover, enzymatic susceptibility of these pretreated mixtures was also improved from 45 to 90 % of glucose yield by increasing pretreatment severity and at 206 ºC glucose yield from enzymatic hydrolysis resulted in 60.1 % and 73.7 % for M1-4 and M2-3, respectively, these results led to the selection of the mixture M2-3 for further processing.

The solid fraction of M2-3 resulted from autohydrolysis (AM2-3) at 206 ºC was subsequently delignified by uncatalyzed ethanol-organosolv process to recover hemicellulose, cellulose and lignin in separate streams. Three factors were evaluated in the experimental design of organosolv process: ethanol concentration (30–80%), temperature (160–200 ºC) and time (20–60 min). Organosolv process showed that the best compromise between lignin removal and cellulose preservation was obtained at highest temperature and ethanol concentration (p-value of 0.05). Maximal delignification (49.40%) was obtained at the highest severity condition (200ºC, 60 min, 80 % EtOH). Moreover, 35.32 g/L glucose, corresponding to a glucose yield of 49.65 %, was produced from enzymatic hydrolysis of delignified biomass. FTIR analysis of the isolated lignins (OL1–OL10) showed that the main lignin structure was not changed, while thermal analysis revealed Tg values from 73 to 85 ºC. All OL presented radical scavenging activity as high as the commercial antioxidant BHT.

Considering the glucose yield of solid fraction from AM2-3 and from organosolv, the last one did not increased enzymatic susceptibility and for this reason the following processes did not include this step. Whereas enzymatic susceptibility improved by increasing pretreatment severity, M2-3 was presented to autohydrolysis pretreatment at 226 ºC .The solid fraction (AM2-3) obtained was submitted to separated hydrolysis and fermentation (SHF) and simultaneous saccharification and fermentation (SSF) for LA production. LA yield on glucose obtained for both assays was 1 g/g, although the volumetric productivity of SSF (2.5 g/Lh) was higher than SHF (0.8 g/Lh). Therefore, the SSF process was optimized through a factorial design to evaluate the effect of independent variables, solids load and enzyme-substrate ratio (ESR), on LA production. The maximum concentration of LA was obtained using the highest solids load (16 %) and with the highest ESR (54 FPU/g). Finally, scale up of LA was performed in a bioreactor under the optimized conditions in Erlenmeyer flasks, being obtained 61.74 g/L of LA at 44 h which corresponds to LA yield of 0.97 g/g.

In order to present a quantitative evaluation of the environmental loads associated with LA production from M2-3, it was compared with the lactic acid production from non-renewable resources and modeled using the Life Cycle Assessment method through SimaPro®. The life cycle approach took into account the raw material, transport, pretreatment, saccharification and fermentation and LA recovery considering 1 tonne of LA as the functional unit. The major environmental savings obtained by replacing one tonne of fossil-based LA by biobased LA are : 4056.60 kg CO2 eq. of global warming potential; 193.03 kBq U235 eq. of ionizing radiation potential; 3.78 kg C2H4 eq of photochemical oxidation potential; 0.73 kg PO4 3- eq freshwater eutrophication potential; 9569.40 kg 1,4-DB eq. of terrestrial ecotoxicity potential; 99.32 kg 1,4-DB eq. of fresh water aquatic ecotoxicity potential; 137.69 kg 1,4-DB eq. of marine aquatic ecotoxicity potential; 94.89 human toxicity potential and 126.63 m2 of land use. Auxiliary chemicals, electricity and enzyme used in the biobased LA production are most relevant to the total environmental impacts. Biobased LA production significantly reduces the impact on the environment, giving 60 % environmental savings compared to fossil-derived LA.

The results obtained in this work demonstrate the potential of lignocellulosic biomass as an unexploited raw material for an economical and environmental viable solution to produce lactic acid by fermentation.

A biomassa lenhocelulósica, como resíduos florestais e agrícolas ou culturas energéticas dedicadas, é uma matéria-prima renovável promissora para a produção de biocombustíveis avançados e químicos de plataforma. O ácido láctico (LA) foi identificado como um de elevado potencial, desempenhando um papel essencial em aplicações industriais, que vão desde a indústria alimentar até às ciências da vida. Além disso, o ácido láctico é amplamente utilizado na produção de polímeros de ácido poliláctico (PLA) verdes, biodegradáveis e biocompatíveis.

A fim de desenvolver um processo eficiente de produção de LA a partir de biomassa lenhocelulósica, complementar à seleção da biomassa, a otimização do processo deve ser realizada. Assim, três operações principais devem ser consideradas: (1) pré-tratamento da biomassa, (2) sacarificação enzimática para obter açúcares fermentáveis através de celulases e (3) fermentação de açúcares por microrganismos adequados ao ácido láctico. A seleção da matéria-prima, bem como o desenvolvimento das principais operações do processo são o foco deste trabalho.

A seleção da matéria-prima centrou-se na avaliação de duas misturas de biomassa lenhocelulósica (M1-4 e M2-3), ecossistemas florestais e vegetação natural, com o objetivo de coproduzir oligossacarídeos, combustível sólido e glucose sob um conceito de biorrefinaria. A seleção das misturas foi baseada em diferentes critérios, nomeadamente a distribuição territorial, risco de incêndio durante os meses de Verão e teor total de açúcar. As duas misturas foram submetidas a um pré-tratamento de autohidrólise em condições não isotérmicas (na gama de 190 ºC - 240 ºC correspondente a uma severidade de 3.71 a 4.82). Ambas as misturas foram comparadas em termos de fracionamento (recuperações de celulose e lenhina e solubilização de hemicelulose) e de suscetibilidade enzimática da celulose. As maiores recuperações de xilanos (62 e 69 %), como xilose e xilooligossacarídeos, foram obtidas para ambas as misturas na fase líquida a 206 ºC. Além disso, a suscetibilidade enzimática destas misturas pré-tratadas foi também melhorada de 45 a 90 % em rendimento da glucose, com o aumento da severidade do pré-tratamento e, a 206 ºC, o rendimento de glucose da hidrólise enzimática resultou em 60.1 % e 73.7 % para M1-4 e M2-3, respectivamente, esses resultados levaram à seleção da mistura M2-3 para os processos posteriores.

A fração sólida resultante da auto-hidrólise (AM2-3) a 206 ºC foi subsequentemente delignificada pelo processo de etanol-organosolv não catalisado para recuperar hemicelulose, celulose e lenhina em fluxos separados. Foram avaliados três fatores no desenho experimental do processo organosolv: concentração de etanol (30-80 %), temperatura (160-200 ºC) e tempo (20-60 min). O processo organosolv mostrou que o melhor compromisso entre a remoção da lignina e a preservação da celulose foi obtido nas condições extremas de temperatura e concentração de etanol (p-value de 0.05). A delignificação máxima (49.40%) foi obtida na condição de maior severidade (200 ºC, 60 min, 80 % EtOH). Além disso, 35.32 g/L de glucose, correspondendo a um rendimento de glucose de 49.65 %, foi produzida a partir da hidrólise enzimática da biomassa delignificada. A análise FTIR das lenhinas isoladas (OL1-OL10) mostrou que a estrutura principal da lenhina não foi alterada, enquanto que a análise térmica revelou valores de Tg de 73 a 85 ºC. Todas as lenhinas (OL1-OL10) apresentavam atividade antioxidante tão elevada quanto o antioxidante comercial BHT.

Considerando o rendimento de glucose da fração sólida do AM2-3 e do organosolv, este último não aumentou a suscetibilidade enzimática e por esse motivo os processos a seguir não incluíram esta etapa. Considerando que a suscetibilidade enzimática melhorou com o aumento da severidade do pré-tratamento, M2-3 foi submetido ao pré-tratamento de auto-hidrólise a 226 ºC. A fração sólida (AM2-3) obtida foi submetida a hidrólise e fermentação em separado (SHF) e sacarificação e fermentação em simultâneo (SSF) para produção de LA. O rendimento de LA em glucose obtido para ambos os ensaios foi de 1 g/g, embora a produtividade volumétrica de SSF (2.5 g/Lh) tenha sido superior a SHF (0.8 g/Lh). Portanto, o processo SSF foi otimizado através de um desenho fatorial para avaliar o efeito das variáveis independentes, carga de sólidos e relação enzima-substrato (ESR), na produção de LA. A concentração máxima de LA foi obtida com a maior carga de sólidos (16 %) e com a maior ESR (54 FPU/g). Por fim, o aumento de escala do LA foi realizado em biorreator nas condições otimizadas nos frascos Erlenmeyer, sendo obtido 61.74 g/L de LA às 44 h que corresponde a rendimento de LA de 0.97 g/g.

Para apresentar uma avaliação quantitativa das cargas ambientais associadas à produção de LA a partir de M2-3, esta foi comparada com a produção de ácido láctico a partir de recursos não renováveis e foi modelada utilizando o método de Avaliação do Ciclo de Vida através do SimaPro®. A abordagem do ciclo de vida teve em conta a matéria-prima, transporte, pré-tratamento, sacarificação e fermentação e recuperação de LA, considerando 1 tonelada de LA como a unidade funcional. As maiores poupanças ambientais obtidas através da substituição de uma tonelada de LA de base fóssil por LA de base biológica são : 4056.60 kg CO2 eq. de potencial de aquecimento global; 193.03 kBq U235 eq. de potencial de radiação ionizante; 3.78 kg C2H4 eq de potencial de oxidação fotoquímica; 0.73 kg PO43- eq de potencial de eutrofização de água doce; 9569.40 kg 1,4-DB eq. de potencial de ecotoxicidade terrestre; 99.32 kg 1,4-DB eq. de potencial de ecotoxicidade aquática de água doce; 137.69 kg 1,4-DB eq. de potencial de ecotoxicidade aquática marinha; 94.89 potencial de toxicidade humana e 126.63 m2 de uso da terra. Os produtos químicos auxiliares, eletricidade e enzimas utilizados na produção de LA de base biológica são os mais relevantes para os impactos ambientais totais. A produção de LA de base biológica reduz significativamente o impacto sobre o ambiente, proporcionando 60 % de poupança ambiental em comparação com o LA de origem fóssil.

Os resultados obtidos neste trabalho demonstram o potencial da biomassa lignocelulósica como matéria-prima inexplorada para uma solução económica e ambientalmente viável para a produção de ácido lático por fermentação.