The role of fungi on monumental stone biodeterioration within the UNESCO World heritage site of “University of Coimbra– Alta and Sofia”

Abstract

Among the distinct microbial populations able to grow in stone monuments, colonization by fungi often results in severe aesthetic, physical and chemical biodeterioration of the substrate. This multidisciplinary thesis attempts to understand the biodeteriorative role of fungal communities thriving in stone monuments present within the UNESCO World heritage site of “University of Coimbra- Alta and Sofia”. Accordingly, this work aims were: (1) to produce a detailed inventory characterizing fungal communities using both classical and -omics approaches in key monuments in this area; (2) to describe novel fungal taxa colonizing these supports; (3) to link the detected fungal species, environmental and stone petrochemical characteristics with the observed deterioration processes; (4) to assess fungal biodeteriorative potential and the studied limestone bioreceptivity; and (5) to evaluate and develop control procedures targeting specific harmful biodeteriorating fungal species. This comprehensive research is started with a set of studies aiming to identify the fungal species and their deteriorative action, in various biodeterioration outlines present in the dolomitic limestone walls of the Old Cathedral of Coimbra. The combined approach using traditional cultivation methodologies coupled with modern Next Generation Sequencing techniques, allowed to identify the fungal communities present in this monument, while also allowing to verify that in similar studies their joined application is advised. During this survey, isolates from an unknown microcolonial black fungal species were retrieved. In order to understand this species taxonomic status, a polyphasic study was conducted, allowing the description of a new family, Aeminiaceae fam. nov., a new genus Aeminium gen. nov., and a new species, Aeminium ludgeri sp. nov. Moreover, considering the significance of this finding and in order to explore gene content and genomic traits, the species genome was also sequenced and thoroughly studied. Several distinctive traits that putatively contribute to the organism extremotolerance and biodeteriorative profile were thus highlighted. In order to further understand fungal dolomitic limestone bioreceptivity and biodeterioration, an extensive analysis aiming to identify biodeteriorative abilities and limestone bioreceptivity to fungi thriving in this site was then conducted. The results showed that a significant number of the tested species contributed to dolomitic limestone biodeterioration and that fungal proliferation was slightly superior in oligotrophic rather than copiotrophic conditions. In the ensuing section, attention is given to a series of studies focusing in the biodeteriorative effects of the proliferation of fungal communities in the relieves adorning the Ançã limestone tomb of the First Portuguese King. A multi-disciplinary approach to fully characterize these phenomena allowed to verify a massive fungal diversity and abundance in this monument, while also pinpointing that the establishment of differential fungal populations coupled with the deposition of environmental particles contributed to the development of the distinct phenomena by various mechanisms. In order to further study Ançã limestone fungal bioreceptivity and biodeterioration, an experimental laboratorial analysis was also carried out. The results revealed that all tested species contributed to the substratum biodeterioration and that Penicillia growth was favored in rich micro-nutrient environments, while Aspergilli and Aeminium ludgeri denoted a slightly more accentuated growth under depleted nutrient conditions. Subsequently, focus is then given to the fungal communities thriving in the Coimbra Roman cryptoporticus and in particular to the presence of whitish mold-like propagations in some areas of this site. Fearing that a putative fungal outbreak could be taking place, the fungal communities in these sites were deeply characterized. The results revealed that these propagations are a result of Lecanicillium psalliotae proliferations and that possible outbreaks by this species are putatively occurring through animal vectored dispersion. In the penultimate section of this thesis, the main advantages of cultivation approaches are highlighted, with the description and biodeteriorative profiling of several unknown filamentous fungal taxa retrieved from the studied monuments. Moreover, one of the species described, exhibited a very high ability to induce the formation of calcium oxalates in vitro, a deteriorative profile that would never be noted, if solely the use of Next-generation sequencing methodologies was considered. Lastly, considering the ongoing efforts to restore and preserve various monuments in this UNESCO area, the final focus in then given to test the in vitro efficiency of chemical biocides previously used in the University tower against various fungal species retrieved during the course of this thesis. Moreover, they were also compared with an increasing attractive green option, Ocimum basilicum essential oil. Altogether, the scientific information developed and gathered during the course of this thesis provides a massive update concerning the current knowledge on fungal limestone interactions and biodeterioration, while also providing a strong evaluation of the current methodologies applied to study them in similar contexts.

Entre as distintas populações microbianas capazes de crescer em monumentos rochosos, a colonização por fungos frequentemente resulta numa severa biodeterioração estética, física e química do substrato. Esta tese multidisciplinar procura compreender o papel biodeteriorativo das comunidades de fungos que prosperam em monumentos de pedra presentes no património mundial da UNESCO da “Universidade de Coimbra-Alta e Sofia”. Assim, os objetivos deste trabalho foram: (1) produzir um inventário detalhado caracterizando as comunidades de fungos, usando para isso abordagens clássicas e -ómicas em monumentos-chave nesta área; (2) descrever novos taxa de fungos que colonizam estes suportes; (3) relacionar as espécies de fungos detectadas, as características ambientais e petroquímicas da rocha com os processos de deterioração observados; (4) avaliar o potencial biodeteriorativo dos fungos e a sua bioreceptividade nos calcários estudados; e (5) avaliar e desenvolver procedimentos de controlo visando espécies específicas de fungos biodeterioradores prejudiciais. Esta abrangente investigação inicia-se com um conjunto de estudos que visam identificar as espécies fúngicas e a sua ação deterioradora nos diversos perfis de biodeterioração presentes nas paredes calcárias dolomíticas da Sé Velha de Coimbra. A abordagem combinada utilizando metodologias de cultivo tradicionais aliadas a modernas técnicas de Sequenciamento de Próxima Geração, permitiu identificar as comunidades fúngicas presentes neste monumento, permitindo também verificar que em estudos semelhantes é aconselhável a sua aplicação conjunta. Durante esta pesquisa, isolados de uma espécie desconhecida de fungo microcolonial negro foram recuperados. Com o objetivo de compreender o status taxonómico desta espécie, foi realizado um estudo polifásico, permitindo a descrição de uma nova família, Aeminiaceae fam. nov., um novo género Aeminium gen. nov., e uma nova espécie, Aeminium ludgeri sp. nov. Além disso, considerando a importância desta descoberta e com o fim de explorar o conteúdo genético e as suas características genómicas, o genoma da espécie foi também sequenciado e estudado exaustivamente. Vários traços distintivos que putativamente contribuem para a extremotolerância do organismo e o seu perfil biodeteriorativo foram assim destacados. A fim de compreender melhor a bioreceptividade e a biodeterioração do calcário dolomítico por espécies fúngicas, foi realizada uma extensa análise com o objetivo de identificar as suas habilidades biodeteriorativas e a bioreceptividade do calcário a fungos que prosperam neste local. Os resultados mostraram que um número significativo das espécies testadas contribuiram para a biodeterioração do calcário dolomítico e que a proliferação de fungos foi ligeiramente superior em condições oligotróficas do que copiotróficas. Na secção seguinte, é dada atenção a um conjunto de estudos que incidem sobre os efeitos biodeteriorativos da proliferação de comunidades fúngicas nos relevos que adornam o túmulo de calcário de Ançã do Primeiro Rei Português. Uma abordagem multidisciplinar para caracterizar completamente esses fenómenos permitiu verificar uma enorme diversidade e abundância de fungos neste monumento, ao mesmo tempo que apontou que o estabelecimento de populações diferenciais de fungos, juntamente com a deposição de partículas ambientais, contribuíram para o desenvolvimento dos distintos fenómenos por vários mecanismos. Com o objetivo de aprofundar o estudo da bioreceptividade e biodeterioração fúngica do calcário de Ançã, foi realizada uma análise laboratorial experimental. Os resultados revelaram que todas as espécies testadas contribuíram para a biodeterioração do substrato e que o crescimento de Penicillia foi favorecido em ambientes ricos em micronutrientes, enquanto Aspergilli e Aeminium ludgeri denotaram um crescimento ligeiramente mais acentuado em condições de depleção de nutrientes. Posteriormente, o enfoque é dado às comunidades de fungos que prosperam no criptopórtico Romano de Coimbra e, em particular, à presença de propagações esbranquiçadas semelhantes a fungos em algumas áreas deste local. Temendo que um possível surto fúngico pudesse estar a ocorrer, as comunidades de fungos nesses locais foram profundamente caracterizadas. Os resultados revelaram que essas propagações são resultado da proliferação de Lecanicillium psalliotae e que possíveis surtos por esta espécie estão a ocorrer putativamente por meio de dispersão vetorial animal. Na penúltima seção desta tese, as principais vantagens das abordagens de cultivo são destacadas, com a descrição e a caracterização do perfil biodeteriorativo de vários taxa de fungos filamentosos desconhecidos e recuperados dos monumentos estudados. Além disso, uma das espécies descritas, exibiu uma capacidade muito elevada de induzir a formação de oxalatos de cálcio in vitro, um perfil de deterioração que nunca seria notado se apenas o uso de metodologias de sequenciamento de próxima geração fosse considerado. Por último, considerando os esforços em curso para restaurar e preservar vários monumentos nesta área da UNESCO, o enfoque final é então dado na testagem da eficácia in vitro de biocidas químicos anteriormente utilizados na torre da Universidade contra várias espécies de fungos recuperadas no decorrer desta tese. Além disso, eles também foram comparados com uma opção verde cada vez mais atraente, o óleo essencial de Ocimum basilicum. No seu conjunto, a informação científica desenvolvida e recolhida ao longo desta tese, fornece uma atualização maciça sobre o conhecimento atual sobre as interações e biodeterioração do calcário fúngico, ao mesmo tempo que fornece uma forte avaliação das metodologias atuais aplicadas para estudá-los em contextos semelhantes.