Molecular and cellular changes triggered by diabetes in the hippocampus: a sweet-bitter connection

Abstract

Diabetic encephalopathy is a complication of diabetes, characterized by brain neurochemical, electrophysiological and structural alterations, and cognitive and memory impairments. In hippocampus, diabetes induces the depletion of synaptic vesicles in nerve terminals and dendritic atrophy of pyramidal neurons, changes the expression of presynaptic proteins involved in exocytosis and affects neurotransmitter release. However, the molecular and cellular alterations caused by diabetes in hippocampus are not fully clarified. Thus, our main goal was to further clarify the effects of diabetes in hippocampus. We gave a particular attention to the molecular changes occurring at the presynaptic level. For that, we evaluated the effect of diabetes, or high glucose, on the content of synaptic proteins involved in exocytosis and on neurotransmitter release. The effect of diabetes on hippocampal neural cells was also evaluated. Diabetes was induced in Wistar rats with a single intraperitoneal injection of streptozotocin. The protein levels of SNAREs (syntaxin-1, VAMP-2 and SNAP-25), synapsin-1, synaptotagmin-1, synaptophysin, and rabphilin 3a were evaluated in purified nerve terminals and in total extracts of hippocampus, during the early stages of diabetes (two, four and eight weeks). In nerve terminals of diabetic animals, the content of syntaxin- 1 decreased at all time points, and SNAP-25 and synapsin-1 decreased at four and eight weeks of diabetes, while synaptophysin content increased at all time points. The content of the remaining proteins was not affected. In total extracts, SNAP-25 and syntaxin-1 content also decreased, but only when more drastic changes were detected in nerve terminals. These results indicate that diabetes differentially affects the content of exocytotic proteins in hippocampal nerve terminals. Since hyperglycemia is considered the main trigger of diabetic complications, we analyzed whether long-term high glucose, which mimics prolonged hyperglycemia, changes the content and localization of synaptic proteins involved in exocytosis in cultured hippocampal neurons. Neurons were exposed for seven days to high glucose (50 mM) or mannitol (25 mM; plus 25 mM D-glucose), which was used as osmotic control. We examined the effect of high glucose in cell death and evaluated the protein levels and cellular localization of the exocytotic proteins mentioned above, and of VGluT-1 and VGAT. Neuronal morphology was not significantly affected by high glucose, although there was a significant increase in the number of apoptotic nuclei. In high glucose-treated cells, the content of SNAP-25 decreased, whereas the content of synaptotagmin-1 and VGluT-1 increased. The remaining proteins were not affected. Moreover, high glucose induced an accumulation of syntaxin-1, synaptotagmin-1 and VGluT-1 in the cell body of some neurons, suggesting that hyperglycemia might affect the trafficking of these proteins to the synapse. Because high glucose did not affect the majority of the proteins, it appears that other factors might contribute to the alterations detected in synaptic proteins in diabetic animals. Since the impairment in exocytosis may contribute to changes in neurotransmitter release, we also evaluated the effect of diabetes (two and eight weeks) on [14C]glutamate and [3H]GABA basal and evoked release in hippocampal nerve terminals. The protein levels of VGluT-1, VGluT-2, VGAT and α1A subunit of P/Q calcium channels were analyzed. At two weeks of diabetes, the content of VGluT-1 and VGluT-2 was not affected, but the content of VGAT and α1A subunit decreased. At eight weeks of diabetes no changes were detected. Regarding neurotransmitter release, diabetes did not affect GABA release at both time points. However, at eight weeks of diabetes the basal release of glutamate increased. These results further indicate that diabetes can affect the pre-synaptic terminal, which may cause impairments in synaptic transmission. Since cognitive impairments can result from neuronal and glial changes in the hippocampus, we investigated the effect of diabetes (two, four and eight weeks) on rat hippocampal neural cells. Potential neurodegeneration was evaluated by cresyl violet staining and by the detection of caspase-3. To identify neuronal changes, the immunoreactivity of MAP-2 and synaptophysin was examined in brain slices, as well as the protein content of three neuronal markers, Tuj-1, tau and calbindin D28k. Astrocyte (GFAP marker) and microglia (CD11b and ED1 markers) reactivity was also evaluated. No signs of neurodegeneration were detected in the hippocampus of diabetic animals. However, the protein levels of all neuronal markers decreased after eight weeks of diabetes. Moreover, MAP-2 immunoreactivity decreased in DG at two, four and eight weeks of diabetes, and at eight weeks decreased in all subregions. Synaptophysin immunoreactivity increased in CA3 subregion at all time points. Although astrocyte reactivity was not changed, the number of active microglial cells increased in DG and CA3 subregions at eight weeks of diabetes. The results indicate that diabetes does not induce neuronal degeneration in hippocampus during the early stages of the disease, but neuronal changes occur, mainly after eight weeks of diabetes, being the CA3 subregion the most affected. The activation of microglial cells indicates that diabetes triggers a pro-inflammatory response in the hippocampus. In conclusion, diabetes induces changes in the presynaptic compartment in the hippocampus, namely in the content of several synaptic proteins involved in exocytosis. Neurotransmitter release can also be affected. Moreover, diabetes induces neuronal changes and triggers a pro-inflammatory response in the hippocampus. Altogether, these alterations might contribute to cognitive impairments detected in diabetic animals and humans.

A encefalopatia diabética é uma complicação associada à diabetes, caracterizada por alterações neuroquímicas, electrofisiológicas, estruturais e cognitivas. No hipocampo, a diabetes induz depleção de vesículas sinápticas nos terminais nervosos, atrofia de dendrites em neurónios piramidais, alterações na expressão de proteínas pré-sinápticas envolvidas na exocitose e também altera a libertação de neurotransmissores. Apesar destas evidências, as alterações moleculares e celulares que ocorrem no hipocampo causadas pela diabetes não estão ainda totalmente esclarecidas. Assim, o principal objectivo deste trabalho consistiu em clarificar os efeitos da diabetes no hipocampo, e em particular identificar alterações moleculares que ocorrem no terminal pré-sináptico. Para isso avaliámos o efeito da diabetes, ou de uma concentração elevada de glicose, no conteúdo de proteínas sinápticas envolvidas na exocitose e na libertação de neurotransmissores. Estudámos também o efeito da diabetes nas células neurais do hipocampo. A diabetes foi induzida em ratos Wistar com uma injecção intraperitoneal de estreptozotocina. O conteúdo proteico das SNAREs (sintaxina-1, VAMP-2 e SNAP-25), sinapsina-1, sinaptotagmina-1, sinaptofisina e rabfilina 3a foi avaliado nos terminais nervosos purificados e extractos totais de hipocampo após duas, quatro e oito semanas de diabetes. Nos terminais nervosos, o conteúdo de sintaxina-1 diminuiu em todos os tempos, e o de SNAP-25 e sinapsina-1 diminuiu apenas após quatro e oito semanas de diabetes. O conteúdo de sinaptofisina aumentou em todos os tempos. Não foram detectadas alterações no conteúdo das restantes proteínas. Em extractos totais, o conteúdo de SNAP- 25 e de sintaxina-1 diminuiu nos períodos em que foram detectadas alterações mais significativas nos terminais nervosos. Estes resultados indicam que a diabetes induz alterações diferenciadas no conteúdo de várias proteínas exocitóticas no hipocampo. Uma vez que a hiperglicémia é considerada o principal factor para o desenvolvimento de complicações da diabetes, avaliou-se se uma exposição prolongada a uma concentração elevada de glicose, que mimetiza hiperglicémia prolongada, altera o conteúdo e localização de proteínas sinápticas envolvidas na exocitose em neurónios de hipocampo em cultura. Os neurónios foram expostos durante sete dias a glicose elevada (50 mM) ou manitol (25 mM; mais 25 mM D-glicose), usado como controlo osmótico. Avaliou-se a viabilidade celular e o conteúdo proteico e localização das proteínas exocitóticas e de VGluT-1 e VGAT. A glicose elevada não alterou a morfologia celular, embora tenha ocorrido um aumento de apoptose. Além disso, diminuiu o conteúdo de SNAP-25, e aumentou o de sinaptotagmina-1 e VGluT-1. O conteúdo das restantes proteínas não se alterou. Também ocorreu uma acumulação de sintaxina-1, sinaptotagmina-1 e VGluT-1 no corpo celular de alguns neurónios, sugerindo que a hiperglicémia pode comprometer o tráfego destas proteínas para a sinapse. Como a glicose elevada não afectou a maioria das proteínas, isto sugere que outros factores podem contribuir para a alteração nas proteínas sinápticas detectadas em animais diabéticos. Uma vez que alterações na exocitose podem afectar a libertação de neurotransmissores, investigou-se o efeito da diabetes (duas e oito semanas) na libertação basal e induzida de [14C]glutamato e [3H]GABA em terminais nervosos de hipocampo, tendo-se analisado também o conteúdo proteico de VGluT-1, VGluT-2, VGAT e da subunidade α1A do canal de cálcio do tipo P/Q. Às duas semanas de diabetes, os níveis de VGluT-1 e VGluT-2 não se alteraram. O conteúdo de VGAT e da subunidade α1A diminuiu nos terminais nervosos, mas não nos extractos totais. Às oito semanas de diabetes não foram observadas alterações. Também não ocorreram alterações na libertação de GABA nos animais diabéticos, mas a libertação basal de glutamato aumentou às oito semanas. Estes resultados indicam que a diabetes induz alterações pré-sinápticas, que podem afectar a transmissão sináptica. Uma vez que as alterações cognitivas podem resultar de alterações neuronais e gliais no hipocampo, avaliou-se o efeito da diabetes (duas, quatro e oito semanas) em células neurais do hipocampo de rato. A neurodegeneração foi avaliada por marcação com violeta de cresilo e por detecção de caspase-3. A análise da imunoreactividade de MAP-2 e sinaptofisina em fatias de cérebro, e do conteúdo proteico de Tuj-1, tau e calbindina D28k, permitiu identificar alterações neuronais. A reactividade de astrócitos (GFAP) e de microglia (CD11b e ED1) também foram analisadas. Embora não se tenha detectado sinais de degeneração no hipocampo dos animais diabéticos, ocorreu uma diminuição de todos os marcadores neuronais após oito semanas de diabetes. A imunoreactividade de MAP-2 diminuiu às duas e quatro semanas no giro dentado e às oito semanas em todas as sub-regiões. A sinaptofisina aumentou nos animais diabéticos na sub-região CA3 em todos os tempos. Embora não tivesse ocorrido reactividade de astrócitos, o número de microglias activas aumentou nas sub-regiões CA3 e giro dentado após oito semanas de diabetes. Estes resultados indicam que embora a diabetes não induza neurodegeneração no hipocampo em fases iniciais da doença, ocorrem alterações neuronais, principalmente às oito semanas de diabetes, sendo a sub-região CA3 a mais afectada. A activação das células da microglia sugere a existência de uma resposta pro-inflamatória no hipocampo induzida pela diabetes. Concluindo, a diabetes induz alterações nos terminais pré-sinápticos do hipocampo, nomeadamente ao nível do conteúdo de várias proteínas sinápticas envolvidas na exocitose, e também na libertação de neurotransmissores. Além disso, as alterações neurais e a activação de um processo pro-inflamatório no hipocampo podem contribuir para a disfunção sináptica e para os problemas cognitivos detectados em animais e pacientes diabéticos.