Mycotoxins in pistachio (Pistacia vera L.): Development and validation of a multi-mycotoxin analytical method using QuEChERS followed by Ultra High-Pressure Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Abstract

The consumption of pistachios (Pistacia vera L.) has been increasing, given its important benefit in human health. In addition to an excellent nutritional source, it has associated chemical hazards, such as mycotoxins, resulting of fungal contamination and its secondary metabolism. Pistachios are one of nuts with higher mycotoxin’s contamination worldwide, especially Aflatoxin B1 with a hepatotoxic effect and classified as proven carcinogenic to humans by the International Agency for Research on Cancer (IARC). More mycotoxins as ochratoxin A (OTA), fumonisins (FBs), zearalenone (ZEA) and trichothecenes (T2, HT2 and DON) and emerging mycotoxins have been concerned in nuts. This study developed a Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe (QuEChERS) method followed by Ultra-High Performance Liquid Chromatography combined with Time-of-Flight Mass Spectrometry (UHPLC–ToF-MS) for the determination of multi-mycotoxins in pistachios.Different approaches in dispersive solid phase extraction (d-SPE) as clean-up for high-lipid matrix were to evaluate. For this, classic sorbents, like C18 (octadecyl modified silica) and PSA (primary secondary amine) and new classes of sorbents, namely EMR-Lipid (enhanced matrix removal-lipid) and Z-Sep (modified silica gel with zirconium oxide) are used. Method with 100 mg Z-Sep sorbent provided the best analytical performance, with good recovery (79 to 120%), repeatability (RSDr<10%) and precision inter-day (RSDR<10%) in agreement with criteria established by Commission Regulation EC No. 401/2006 for mycotoxins analysis. The method was validated for aflatoxins (AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2), ochratoxin A (OTA), zearalenone (ZEA), toxin T2 (T2) and toxin HT-2 (HT2). The LODs for AFs ranged from 0.125 to 0.25 ug/Kg, which are lower than the maximum levels in nuts regulated by the EU. The method was applied to 16 real pistachio samples and 6 of these presented one mycotoxin (AFB1, HT2 or FB1) but at low concentrations. The concentration of AFB1 was lower than the maximum permitted level established by the EU legislation. Also, AFB2 and FB1 are detected in pistachio shells. In this line, pistachios samples selected in the present study and available in the Portuguese market are safe for human consumption concerning mycotoxins content.

O consumo de pistácios (Pistacia vera L.) tem vindo a aumentar devido ao seu reconhecido benefício na saúde humana. Apesar de constituírem uma excelente fonte nutricional, os pistácios têm riscos químicos associados, como as micotoxinas, resultantes da contaminação de fungos e do seu metabolismo secundário. Os pistácios são um dos frutos secos com maior contaminação por micotoxinas em todo o mundo, especialmente por aflatoxinas. As aflatoxinas são as mais tóxicas para os seres humanos, particularmente a aflatoxina B1 com efeito hepatotóxico e classificada como comprovadamente carcinogénica para o homem pela Agência Internacional para a Investigação do Cancro (IARC). Outras micotoxinas são relevantes como ocratoxina A (OTA), fumonisinas (FBs), zearalenone (ZEA) e trichotecenes (T2, HT2 e DON) e mais recentemente, as micotoxinas emergentes.Este estudo desenvolveu um método rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro (QuEChERS) seguido de Cromatografia Líquida de Ultra Resolução combinada com Espectrometria de Massa de Tempo de Voo (UHPLC-ToF-MS) para a determinação das micotoxinas em pistácios. Diferentes abordagens no clean-up pela técnica de extração de Fase Sólida Dispersiva (d-SPE) foram avaliadas. Para isso, foram utilizados adsorventes clássicos, como C18 (octadecil sílica) e PSA (amina secundária primária) e novas classes de adsorventes, nomeadamente, EMR-Lipid (enhanced matrix removal-lipid) e Z-Sep (gel de sílica modificada com óxido de zircónio). O método com 100 mg de Z-Sep proporcionou o melhor desempenho analítico, com uma boa recuperação (79 a 120%), boa repetibilidade (RSDr<10%) e a boa precisão inter-dia (RSDR<10%) de acordo com critérios estabelecidos pelo Regulamento N.º 401/2006 da Comissão Europeia para a análise das micotoxinas. O método foi validado para aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2), ocratoxina A (OTA), zearalenona (ZEA), toxina T2 (T2) e toxina HT-2 (HT2). Os LODs para as AFs variaram entre 0,125 e 0,25 ug/Kg, concentrações inferiores aos níveis máximos para frutos secos regulados pela UE. O método foi aplicado a 16 amostras de pistácios e em 6 destas foi determinada uma micotoxina (AFB1, HT2 ou FB1), mas em baixas concentrações. A concentração de AFB1 foi inferior ao valor máximo permitido de acordo com a legislação da União Europeia. Além disso, AFB2 e FB1 foram detetadas nas cascas de pistácios. Assim, os pistácios selecionados para o presente estudo e disponíveis no mercado português são considerados seguros para o consumo humano no que diz respeito à presença de micotoxinas.