Validation of Analytical Methodologies for Determination of Mycotoxins and Pesticides in Cereals

Abstract

Os cereais são as espécies de plantas mais antigas que os Humanos plantaram e constituem uma fonte essencial de energia e nutrientes (apresentam elevado valor nutritivo) da dieta humana. Mais de 60% de toda a produção agrícola é composta por culturas de cereais. Estima-se que 2.799 milhões de toneladas de cereais foram produzidas em 2022, com uma grande quantidade de grãos, principalmente de trigo, milho e arroz. Os cereais devem ser estudos no que respeita aos seus potenciais contaminantes, como as micotoxinas, bem como resíduos de pesticidas, para garantir a segurança alimentar e consequentemente a saúde dos consumidores.Este estudo validou duas metodologias analíticas diferentes, uma tecnologia de biochip (BAT) para o screening de multi-micotoxinas em cereais e um método LC-MS/MS para a determinação de resíduos de pesticidas em arroz. Além disso, avaliaram-se os Fatores de Processamento e percentagens de redução em amostras contaminadas de arroz agulha submetidos a diferentes métodos de processamento (lavagem com água, lavagem com vinagre, cozimento convencional e cozimento a vapor e suas combinações).O estudo de micotoxinas foca-se na validação de um BAT para o screening de multi-micotoxinas em arroz, estendida adicionalmente a outros cereais, como aveia, cevada, centeio e trigo. O Evidence Investigator Myco 7 (RANDOX Food Diagnostic), baseado num imunoensaio quimioluminescente competitivo, foi utilizado para a deteção simultânea semiquantitativa de micotoxinas: aflatoxina B1 (AFB1) e aflatoxina G1 (AFG1), ocratoxina A (OTA), zearalenona (ZEA), toxina T2 e HT2 (soma de T2 e HT2), fumonisinas (soma de FB1 e FB2) e deoxinivalenol (DON). Foi utilizada uma extração com acetonitrilo:metanol:água (50:40:10, v/v/v). De acordo com os resultados da validação, as amostras de arroz fortificado apresentaram resultados falsos <5%, de acordo com os critérios impostos na legislação da União Europeia. Nas amostras fortificadas dos outros cereais, não houve falsos positivos e apenas 5% de falsos negativos para as micotoxinas FB1+FB2, OTA, AFB1 e T2+HT2. O imunoensaio BAT fornece vantagens importantes para a triagem rápida e eficiente de várias micotoxinas em amostras de cereais e amostras derivadas de cereais. O procedimento de triagem permite que apenas amostras suspeitas de contaminação sejam submetidas a testes de confirmação usando uma técnica mais precisa, como o LC-MS/MS.No estudo dos pesticidas, foi validado um método para determinar 121 resíduos de pesticidas em amostras de arroz, de acordo com as diretrizes do documento SANTE/11312/2021. O método de extração escolhido para análise de resíduos de pesticidas foi o QuEChERS (Rápido, Fácil, Barato, Eficaz, Robusto e Seguro) e o extrato foi analisado por Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massa (HPLC-MS/MS). As gamas de trabalho das curvas de calibração encontraram-se entre 5–100, 10–100 ou 50-100 µg/L, dependendo do pesticida. O limite de quantificação foi de 5, 10 ou 50 µg/kg, dependendo também da molécula. A metodologia mostrou-se precisa (recuperação 70 - 119%) e foi aplicada a amostras comerciais de arroz. Quatro amostras de arroz comercial, entre elas uma de arroz agulha, uma de arroz basmati, uma de arroz integral e uma de arroz carolino foram analisadas quanto à sua potencial contaminação no que respeita aos 121 resíduos de pesticidas incluídos no método HPLC-MS/MS validado. Todas as amostras foram negativas para os resíduos de pesticidas analisados. Outro objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da lavagem, com vinagre (5%, v/v) e sem vinagre, do cozimento convencional, do cozimento a vapor e da sua combinação nos níveis de resíduos de 121 pesticidas em arroz agulha. Uma porção de 200 g de amostra de arroz não contaminada foi submersa em 400 mL de água mineral contendo os pesticidas numa concentração final de 50 μg/kg e, em seguida, os efeitos de processamento (da lavagem, e/ou do cozimento e a sua combinação), foram investigados. Em relação à lavagem, a que apresentou maior eficácia na redução dos resíduos de pesticidas foi a lavagem com vinagre (5%, v/v), em 26,8-80,3%. A remoção de resíduos de pesticidas devido ao processamento é afetada pelo grau de absorção dos pesticidas pelos grãos dos cereais, pela solubilidade dos resíduos de pesticidas na água e pela degradação induzida pelo calor. As amostras de arroz submetidas aos dois métodos de processamento (lavagem com vinagre e cozimento) foram as que apresentaram maiores fatores de redução. Portanto, recomenda-se a utilização, a nível doméstico e industrial, de ambos os métodos para melhor garantir a segurança alimentar do arroz.

Cereal crops are the earliest plant species that Humans have planted, and they constitute a key source of energy and nourishment (high nutritive qualities) in the human diet globally. More than 60% of all agricultural production is comprised of cereal crops. An estimated 2799 million tons of cereals were produced in 2022, with a large amount of coarse grains, mainly of wheat, maize, and rice. Cereals must be screened for contaminants such as mycotoxins as well as pesticide residues both to protect the health of consumers and due to food security. This study validated two different analytical methodologies, a Biochip Array Technology (BAT) for multi-mycotoxins screening in cereals and a LC-MS/MS method to determine pesticides residues in rice. Moreover, it has evaluated the processing factors and reduction percentages in contaminated long-grain rice samples submitted to different processing methods (washing with mineral water, washing with vinegar, conventional cooking and steam cooking and their combinations). The study of mycotoxins focuses on the validation of a BAT for multi-mycotoxins screening in rice, additionally extended to other cereals, like, oat, barley, rye, and wheat. The Evidence Investigator Myco 7 (RANDOX Food Diagnostic), based in a competitive chemiluminescent immunoassay, was used for the simultaneous semi-quantitative detection of the mycotoxins immunoassays: aflatoxin B1 (AFB1) and aflatoxin G1 (AFG1), ochratoxin A (OTA), zearalenone (ZEA), toxin T2 and HT2 (sum of T2 and HT2), fumonisins (sum of FB1 and FB2) and deoxynivalenol (DON). A single extraction step with acetonitrile:methanol:water (50:40:10, v/v/v) was used. According to validation results, spiked rice samples showed false results <5 %, in agreement with European Union legislation performance criteria. In the spiked samples of other cereals, any false positives were found and only 5% of false negatives were found for FB1+FB2, OTA, AFB1 and T2+HT2. The BAT immunoassay provides important benefits for the rapid and efficient screening of several mycotoxins from feed and food cereal-based samples at various levels. The screening procedure is further made easier by the multi-analytical approach because only samples suspected of contamination need confirmation testing using a more precise technique, like LC-MS/MS.In the study of pesticides, a method was validated allowing to determine 121 pesticide residues in rice samples, according to the guidance document SANTE/11312/2021. QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) was chosen for pesticides extraction method and the extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The linear ranges of the calibration curves were between 5–100, 10–100 or 50-100 µg/L, depending on the pesticide. The limit of quantification was 5, 10, or 50 µg/kg. The methodology was shown to be precise and accurate (recovery 70.0-119%) and was applied to commercial samples of rice. Four commercial rice samples, one long grain rice, one basmati, one brown rice and one Carolino (short grain) rice were analyzed regarding their content in the 121 pesticide residues included in the HPLC- MS/MS method. All samples were negative for pesticide residues. Another objective of the study was to evaluate the effects of washing, washing with vinegar (5%, v/v), conventional cooking, steam cooking and their combination on residue levels of 121 pesticides in long grain contaminated rice samples. A 200 g portion of non-contaminated rice sample was soaked in 400 mL of water containing the pesticides at final concentration 50 μg/kg and then, the effects of processing (washing and/or cooking and their combination) were assessed. Regarding washing, the method using vinegar (5%, v/v) showed the highest effectiveness in reducing pesticides residues (from 26.8-80.3%). The washing effect was not associated with the water solubility of the pesticides or their chemical structure. The removal of pesticide residues due to processing is affected by the degree of adsorption of pesticides by the cereals’ grains, pesticide residues’ solubility in water and heat-induced breakdown. The rice samples submitted to both processing methods (wash with vinegar and cooking) presented higher reduction factors. Therefore, it is recommended to use, at domestic and industrial levels, both methods in order to better guarantee food safety of rice.