Unraveling Neurovascular Dysfunctions in Machado-Joseph Disease: Mesenchymal Stromal Cells as a Promising Therapy

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD), also known as Spinocerebellar Ataxia type 3 (SCA3), is an autosomal dominantly inherited neurodegenerative disorder. It is caused by an abnormal CAG repeat expansion within the coding region of the MJD1/ATXN3 gene, resulting in the expression of a mutant ataxin-3 protein. This mutation confers a toxic gain-of-function to ataxin-3 that contributes to the dysfunction of vital cellular mechanisms, culminating in widespread neuronal degeneration across multiple brain regions, including the cerebellum, brainstem, and basal ganglia. Currently, no therapy can cure or delay MJD progression. Although the primary cause of MJD is well known, the underlying mechanisms driving disease progression remain unclear. Recognizing the significant role of cerebrovascular dysfunction in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, the present work aimed to comprehensively characterize neurovascular dysregulations, particularly the blood-brain barrier (BBB) disruption, in the context of MJD. Additionally, given the promising potential of mesenchymal stromal cells (MSC) in: 1) addressing MJD symptoms and 2) rescuing BBB integrity in cerebrovascular disorders, we also aimed to investigate whether MSC could ameliorate vascular abnormalities in an MJD mouse model.This thesis is organized into five chapters.Chapter 1 provides a review of the primary literature regarding MJD and neurovasculature, with a particular focus on the BBB, along with a review of the therapeutic potential of MSC in brain disorders.In Chapter 2, we evaluated structural and functional cerebrovascular alterations in different stages of MJD progression, primarily using the Tg-ATXN3-69Q mouse model (severe phenotype; cerebellar expression of mutant ataxin-3). Vascular density within the cerebellum was increased. Alterations in cerebral vascular blood volume, blood clearance, and α-smooth muscle actin expression (a protein involved in vascular contractility) were observed, suggesting compromised vascular function in this model. Moreover, we found evidence of inflammation in vascular endothelial cells, as vWF expression in endothelial cells was decreased, and astrogliosis. We also observe an activation of the inflammatory nuclear factor-κB (NF-κB) pathway, which can contribute to BBB disruption. Furthermore, we also found evidence of vascular dysfunction in multiple brain regions in the YAC-MJD84.2 mouse model (milder symptoms; ubiquitous expression of mutant ataxin-3). These severe cerebrovascular dysregulations were shown to change with disease stage, were often sex-specific, and preceded major BBB breakdown.In Chapter 3, we investigate the molecular mechanisms underlying BBB dysfunction in MJD, focusing on tight junction (TJ) and adherent junction (AJ) complexes. We observed dysregulation in the expression, cleavage, and subcellular location of key transmembrane TJ/AJ proteins (Occludin, Claudin-5, and VE-cadherin) and cytoplasmic adaptor ZO-1. Dysregulations of the Pi3K/Akt/FoxO1 pathway suggest that complex regulatory networks influence TJ proteins in MJD. These alterations were region-specific and disease-stage-dependent, certainly contributing to the increased BBB permeability observed in MJD.In Chapter 4, we explored the therapeutic potential of MSC administration in alleviating vascular abnormalities and BBB disruption in MJD. MSC treatment in the Tg-ATXN3-69Q model improved motor performance, attenuated vascular dysfunction, and partially reversed the redistribution of essential TJ and AJ-associated proteins. Notably, and according to the alterations noted in disease mice, MSC administration had a sex-specific effect on BBB integrity. This study suggests that MSC could be a promising strategy for treating MJD, being able to target vascular impairments.In the end, Chapter 5 synthesizes the findings in Chapters 2, 3, and 4, discusses their implications, and outlines future perspectives. In summary, this work provides an in-depth understanding of the complex interplay between cerebrovascular alterations, BBB dysfunction, and MJD progression. Furthermore, it unveils vascular modulation as a critical mechanism by which MSC exert their therapeutic potential in MJD. This integrative approach deepens our insight into the pathophysiology of the disease and adds to our understanding of MSC-based therapeutic strategies for polyQ disorders.

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como Ataxia Espinocerebelosa tipo 3 (AEC3), é uma doença neurodegenerativa hereditária, autossómica dominante. Esta doença é causada pela expansão patológica no número de repetições de CAG no gene MJD1/ATXN3, que passa a codificar para uma proteína ataxina-3 mutante. Esta mutação confere à ataxina-3 funções tóxicas, contribuindo para graves disfunções em mecanismos celulares vitais, culminando na neurodegenerescência que compromete múltiplas regiões do cérebro, incluindo o cerebelo, tronco cerebral e os gânglios da base. Atualmente, não existe nenhuma terapia que cure ou retarde eficientemente a progressão da DMJ. Embora a causa primária da DMJ esteja bem descrita, os mecanismos moleculares que contribuem para a progressão da doença não estão totalmente esclarecidos.Tendo em conta o papel significativo da disfunção cerebrovascular na fisiopatologia das doenças neurodegenerativas, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar as desregulações neurovasculares, particularmente a rutura da barreira hematoencefálica (BHE), no contexto da DMJ. Além disso, dado o potencial das células mesenquimatosas do estroma (CME) em: 1) aliviar os sintomas da DMJ e 2) resgatar a integridade da BHE em doenças cerebrovasculares, também tivemos como objetivo investigar se as CME poderiam melhorar as alterações vasculares num modelo animal de DMJ.Esta tese está organizada em cinco capítulos. O Capítulo 1 oferece uma revisão da literatura sobre a DMJ e a neurovasculatura, focando particularmente na BHE, juntamente com uma revisão do potencial terapêutico das CME em doenças do cérebro.No Capítulo 2, avaliámos alterações cerebrovasculares estruturais e funcionais em diferentes estágios da progressão da DMJ, focando principalmente no modelo de murganho Tg-ATXN3-69Q (fenótipo grave; expressão cerebelar de ataxina-3 mutante). Neste modelo a densidade vascular dentro do cerebelo estava aumentada. Observaram-se alterações no volume sanguíneo vascular cerebral, no clearance sanguíneo e na expressão da α-actina de músculo liso (uma proteína envolvida na contratibilidade vascular), o que sugere que a função vascular está comprometida neste modelo. Além disso, encontrámos evidências de inflamação nas células endoteliais vasculares, pois a expressão de vWF nas células endoteliais estava diminuída, e astrogliose. Também detetámos a ativação da via NF-κB, o que pode contribuir para a quebra da BHE. Adicionalmente, encontrámos evidências de disfunção vascular em múltiplas regiões cerebrais no modelo YAC-MJD84.2 (sintomas mais brandos; expressão ubíqua de ataxina-3 mutante). Demonstrou-se que essas desregulações cerebrovasculares graves mudavam com o estadio da doença, eram frequentemente influenciadas pelo sexo e precediam a quebra extensiva da BHE.No Capítulo 3, investigámos os mecanismos moleculares subjacentes à disfunção da BHE na DMJ, focando nos complexos de junções oclusa (TJ) e junções aderentes (AJ). Detetámos a desregulação da expressão, clivagem e localização subcelular das principais proteínas transmembranares das TJ/AJ (Ocludina, Claudina-5 e VE-caderina) e do adaptador citoplasmático zonula occludens (ZO)-1. A presença de desregulações na via Fosfoinositídeo 3-quinases/Proteína quinase B/Proteína Forkhead box O1 (PI3K/Akt/FoxO1) sugere que alterações nas complexas vias regulatórias influenciam a expressão e função das proteínas de TJ na DMJ. Essas alterações eram dependentes da região cerebral e do estadio da doença, certamente contribuindo para o aumento da permeabilidade da BHE na DMJ.No Capítulo 4, explorámos o potencial terapêutico da administração de CME na atenuação das alterações vasculares e na quebra da BHE na DMJ. O tratamento com CME no modelo Tg-ATXN3-69Q melhorou o desempenho motor, atenuou a disfunção vascular e reverteu parcialmente a redistribuição das principais proteínas de TJ e AJ. A administração de CME teve um efeito sexo-específico na integridade da BHE. Este estudo sugere que as CME podem ser uma estratégia promissora para tratar a DMJ, sendo capazes de modelar as deficiências vasculares.No final, o Capítulo 5 sintetiza as conclusões dos Capítulos 2, 3 e 4, discute as suas implicações e descreve perspetivas futuras.Em suma, este trabalho fornece uma descrição da interação complexa entre as alterações cerebrovasculares, a disfunção da BHE e a progressão da DMJ. Além disso, revela que a modulação vascular é um mecanismo central no efeito terapêutico das CME na DMJ. Este trabalho aprofunda a nossa visão sobre a fisiopatologia da DMJ e contribui para nosso conhecimento da aplicação das estratégias terapêuticas baseadas em CME para doenças PolyQ.