Cinética de agregação da proteína transtirretina: contribuição para a compreensão dos processos de formação de amilóide

Abstract

Em patologias amiloidóticas, como a doença de Alzheimer, Encefalopatias Espongiformes e a Polineuropatia Amiloidótica Familiar, proteínas normalmente solúveis sofrem alterações conformacionais e agregam sob a forma de fibras amilóides altamente estáveis, mas insolúveis. Fibras amilóides formadas pela proteína homotetramérica plasmática Transtirretina (TTR) são responsáveis por três doenças amilóides: Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF) e Amiloidose Senil Sistémica (ASS). A ASS é causada pela proteína normal (TTR-WT), enquanto que nas outras doenças as fibras amilóides são constituídas maioritariamente por variantes de TTR. O processo de formação de fibras amilóides pela TTR é iniciado pela dissociação da estrutura tetramérica nativa da TTR em intermediários monoméricos não-nativos que agregam até à formação de fibras amilóides. Este trabalho surge no sentido de caracterizar cineticamente as várias etapas do processo de agregação da TTR-WT, desde a formação do intermediário monomérico amiloidogénico até à formação das fibras amilóides, partindo de monómeros desnaturados a pH 2,0. O processo de agregação de TTR-WT foi iniciado pela adição de NaCl 100 mM aos monómeros desnaturados. Este processo pode ser dividido em duas fases principais. Na fase inicial, os monómeros desnaturados sofrem uma mudança conformacional originando um monómero parcialmente desnaturado e mais compacto (molten globule) susceptível a agregar em pequenos oligómeros. A monitorização desta fase inicial foi seguida por dicroismo circular (CD) no UV-longínquo e próximo, fluorescência e cromatografia de exclusão molecular acoplada a um detector multiangular de dispersão da luz (SEC-MALLS). Os dados experimentais mostram que são necessários dois passos cinéticos para descrever o mecanismo desta fase inicial do processo de agregação da TTR, com a formação de um intermediário (molten globule). Assim, o mecanismo cinético mais simples proposto para esta primeira fase no processo de agregação é constituído por três estados: U MG SA, onde U representa o monómero desnaturado, MG o molten globule e SA pequenos agregados solúveis. O ajuste de uma função aos pontos experimentais permitiu a obtenção das constantes de velocidade, em que a formação dos pequenos agregados é o passo determinante deste mecanismo e é dependente da concentração de proteína. Depois da formação dos primeiros agregados, o progresso da agregação foi seguido por CD no UV-longínquo. Os resultados experimentais obtidos demonstram a existência de um mecanismo de nucleação seguido do crescimento rápido destes núcleos até à formação de fibras amilóides. Nesta fase de agregação, foi usado o modelo cinético de Finke-Watzky de dois passos: SA A; SA + A 2A, onde A representa agregados de elevado peso molecular. O ajuste de uma função aos pontos experimentais permitiu a obtenção das respectivas constantes de velocidade. A confirmação da formação de fibras amilóides foi feita através de microscopia electrónica de transmissão (TEM) e por recurso a ensaios com Tioflavina-T (Th-T), uma sonda fluorescente tradicionalmente usada para a detecção de fibras amilóides em solução.