Molecular Cascades in Midbrain Dopaminenergic Neuron Development: Emphasis on Wnts

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder that affects midbrain dopaminergic (DAergic) neurons in the substantia nigra, leading to a gradual depletion of dopamine (DA) in the striatum. Despite the increasing knowledge of the mechanisms underlying this degenerative process, some features of the disease remain elusive, with no cure for PD presently available. DAergic cell replacement therapy (CRT) has emerged in recent years as a possible approach to treat PD. The possibility of generating new DAergic neurons from stem cells in vitro and transplanting them into PD patients’ brains represents a promising treatment that requires in depth knowledge of the molecular cascades regulating the generation of DAergic neurons during embryogenesis and their maintenance. However, this knowledge remains limited, hindering the use of correctly specified DAergic neurons for transplantation. During the development of the ventral midbrain (VM), the assignment of regional identity and neuronal fate is controlled by sequential events requiring spatially and temporally coordinated interaction between organizing centers that emit inducing signals and responding cells that interpret these signals. One family of signaling proteins, which is crucial for midbrain development, is the Wnt family of proteins. The Wnt signaling pathway regulates neural patterning, cell fate determination, proliferation, differentiation, and neuronal maturation during vertebrate development. Wnt1 and Wnt5a are important morphogens, required for VM development, regulating progenitor proliferation and differentiation as well as specification and survival of DAergic neurons. Previous results have demonstrated a role for Wnt1 in promoting the proliferation of DAergic precursors and for Wnt5a in potentiating the final steps of differentiation in VM primary cultures. Nevertheless, a precise knowledge of the molecular cascades regulated by those morphogens during VM DAergic development is just beginning to emerge. This thesis identifies a novel player in the Wnt5a/ß-catenin-independent pathway during midbrain development, Tiam1, and investigates the gene regulation cascades by which a major ligand, Wnt1, regulates DAergic neuron development. In this thesis, evidence is presented that Wnt1, which signals through the Wnt/ßcatenin pathway, is an important component of DAergic neuron development. We provide evidence that Wnt1 coordinates the expression of genes involved in the specification and neurogenesis of midbrain DAergic neurons, such as Shh, Lmx1a, Otx2 En1, Nurr1 and Ngn2. Moreover, we demonstrate for the first time that some of these genes (Lmx1a, Otx2 and Ngn2) are regulated in a dose-dependent manner and in a positive or negative manner depending on the developmental time. Finally, we have observed that Wnt1 levels in the progenitor cells in expansion correlate with the number of finally differentiated DAergic neurons, emphasizing the importance of Wnt1 in the early inductive events that link to later differentiation processes in midbrain DAergic neuron development. In another study, we have identified Tiam1, a Rac1-guanine exchange factor, as a novel regulator of the Wnt5a/Dvl/Rac1 signaling pathway, a Wnt/ß-cateninindependent pathway, in midbrain DAergic cells. Wnt5a had been previously identified as DAergic pro-differentiation factor and this effect was show to be mediated by Rac1, a small GTPase. After knocking down Tiam1 in VM progenitor cultures, we have not only unraveled its functional requirement in Wnt5a-induced Rac1 activation, but also its role in Wnt5a-mediated induction of DAergic differentiation. In summary, our data has broadened our knowledge on the gene regulation cascades regulated by Wnts during DAergic development and identifies a novel Wntsignaling regulator of DAergic differentiation. We hope that this knowledge can contribute to the development of novel treatments for PD, including CRTs.

A doença de Parkinson é causada por uma degeneração progressiva dos neurónios dopaminérgicos da substantia nigra, levando a um desaparecimento gradual de dopamina no estriado. Apesar do conhecimento crescente sobre os mecanismos subjacentes ao processo degenerativo, algumas características da doença permanecem vagas, não havendo atualmente cura para a doença. A terapia celular surgiu nos últimos anos como uma abordagem possível para o tratamento do parkinsonismo. A possibilidade de gerar novos neurónios dopaminérgicos in vitro e transplantá-los nos cérebros dos doentes de Parkinson representa uma estratégia promissora de tratamento que requer um conhecimento aprofundado das cascatas moleculares que regulam a geração de neurónios dopaminérgicos durante a embriogénese. No entanto, esse conhecimento é ainda limitado, dificultando a geração de neurónios dopaminérgicos corretamente especificados para transplantação. Durante o desenvolvimento do mesencéfalo ventral, a atribuição de identidade regional e destino neuronal é controlada por eventos sequenciais, que exigem uma interação coordenada a nível espacial e temporal entre centros de organização que emitem sinais indutores e células que interpretam esses sinais. Uma família de proteínas de sinalização que revelou ser crucial durante o desenvolvimento do mesencéfalo é a família de proteínas Wnt. A via de sinalização Wnt demonstrou regular a determinação do destino celular, proliferação, diferenciação e maturação neuronal durante o desenvolvimento dos vertebrados. Wnt1 e Wnt5a são dois morfogénios cruciais para o desenvolvimento do mesencéfalo ventral, regulando a proliferação, diferenciação e sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos. Resultados anteriores demonstraram que o Wnt1 é requerido durante a proliferação de precursores dopaminérgicos, enquanto o Wnt5a é requerido durante as etapas finais da diferenciação em neurónios dopaminérgicos em culturas primárias de mesencéfalo ventral. No entanto, é necessário um conhecimento aprofundado acerca das cascatas moleculares intermediárias reguladas por esses morfogénios durante o desenvolvimento do mesencéfalo ventral, antes da sua potencial utilização a nível da terapia celular. Desta forma, esta tese identifica um novo componente na via Wnt5a/ß-catenina-independente durante o desenvolvimento do mesencéfalo e analisa as cascatas de regulação genética pelo qual o Wnt1 regula o desenvolvimento dos neurónios dopaminérgicos. Neste trabalho mostra-se que o Wnt1, que sinaliza através da via Wnt/ßcatenina- dependente, é um componente importante do desenvolvimento dos neurónios dopaminérgicos. Além disso, verifica-se que o Wnt1 coordena a expressão de genes envolvidos na especificação e neurogénese do mesencéfalo ventral, tais como Shh, Lmx1a, En1 Otx2, Nurr1 e Ngn2. Por outro lado, demonstra-se, pela primeira vez, que alguns destes genes (Otx2, Lmx1a e Ngn2) são regulados num tempo específico, de uma forma dependente da concentração de Wnt1. Finalmente, observámos que os níveis de Wnt1 nas células progenitoras em expansão se correlacionam com o número de neurónios dopaminérgicos diferenciados, dando ênfase à importância do Wnt1 nos primeiros eventos indutivos no mesencéfalo, nomeadamente na promoção da diferenciação dopaminérgica. Adicionalmente, identificámos o Tiam1 (um fator de troca do nucleótido guanina (GEF) da Rac1) como um regulador da via de sinalização Wnt5a/Dvl/Rac1, uma via Wnt/ß-catenina-independente, em células dopaminérgicas do mesencéfalo ventral. O Wnt5a foi anteriormente identificado como um fator de pró-diferenciação dopaminérgica, por um processo mediado por Rac1, uma pequena GTPase. Após knockdown do Tiam1 em culturas de progenitores do mesencéfalo ventral verificámos a sua importância funcional não só na ativação da Rac1 induzida por Wnt5a, como também na indução da diferenciação dopaminérgica mediada por Wnt5a. Em resumo, os nossos resultados permitem ampliar o conhecimento das cascatas moleculares reguladas por Wnts durante o desenvolvimento do mesencéfalo ventral e descrever um novo regulador da via de sinalização Wnt5a/Dvl/Rac1, crucial durante o processo de diferenciação dopaminérgica. Esperamos que este conhecimento possa contribuir para a otimização das atuais terapias celulares utilizadas no tratamento da doença de Parkinson.