Impact of methamphetamine on astrocytes and endothelial cells : role of aquaporin-4

Abstract

A metanfetamina (MET) é uma droga psicoestimulante altamente viciante cujo consumo na Europa tem vindo a aumentar nos últimos anos. Vários estudos têm demonstrado que o stress oxidativo, a excitotoxicidade, inflamação e a disfunção mitocondrial são alguns dos efeitos neurotóxicos da MET. Recentemente foi demonstrado que a MET compromete a função da barreira hemato-encefálica (BHE) e causa edema cerebral. A BHE é uma estrutura responsável por proteger o cérebro de compostos tóxicos, mas também permite a passagem de nutrientes e várias moléculas importantes para o parênquima cerebral. A função de barreira é determinada pelas células endoteliais, que em conjunto com os pericitos, astrócitos, lâmina basal, microglia e neurónios formam a unidade neurovascular. Entre as diferentes regiões cerebrais, bem como entre o parênquima cerebral e a corrente sanguínea, ocorre constantemente um grande fluxo de água e perturbações na homeostasia da água podem ter efeitos prejudiciais na função cerebral. As aquaporinas (AQPs) são canais de água responsáveis pelo transporte de água através da BHE, sendo a AQP4 uma das mais importantes no Sistema Nervoso Central (SNC). A AQP4 é expressa nas extremidades dos astrócitos que estão em contacto com os vasos sanguíneos. Além disso, alterações na AQP4 podem levar à formação de edema cerebral devido a um aumento anormal do conteúdo de água no cérebro e um consequente inchaço cerebral. De facto, o edema cerebral tem sido observado em várias neuropatologias, incluindo em condições de consumo de MET. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se a MET induz alterações na expressão da AQP4 e qual o papel dos astrócitos na toxicidade induzida por MET em células endoteliais. Os nossos resultados mostram que a MET leva a um aumento da expressão de AQP4 em culturas primárias de astrócitos, sem interferir com os níveis da proteína glial fibrilar acídica (GFAP - Glial Fibrillary Acidic Protein). Além disso, também testámos o efeito desta droga num modelo animal de intoxicação por MET (binge). Com este protocolo mostrámos que a MET induz um aumento da expressão da AQP4 no hipocampo e uma diminuição no córtex pré-frontal, mostrando que as diferentes regiões apresentam diferente suscetibilidade para a MET. No entanto, quando avaliámos o conteúdo de água no cérebro total não observámos alterações significativas. Tendo em consideração o papel dos astrócitos na função da BHE, usámos para os estudos seguintes uma linha celular de células endoteliais de murganho (bEnd.3). Foi possível concluir que os meios condicionados de astrócitos (MCA) protegeram as células endoteliais (CEs) da morte celular induzida por MET (3 mM). No entanto, quando expusemos as CEs aos MCA 12 recolhidos de células expostas a concentração não tóxicas de MET (1 μM e 50 μM), observámos uma diminuição da expressão das proteínas das junções oclusivas (JOs), ocludina e claudina-5, mas não se verificou nenhum efeito na condição MCA controlo. Em suma, os nossos resultados mostram que a MET causa alterações na expressão da AQP4 quer em culturas primárias de astrócitos quer no hipocampo de murganhos. Além disso, os astrócitos numa situação controlo parecem proteger as células endoteliais da morte celular induzida por MET, mas quando previamente expostos a MET os astrócitos provavelmente libertam fatores que interferem negativamente com a expressão de proteínas da JOs o que em última análise pode aumentar a permeabilidade da barreira.

Methamphetamine (METH) is a potent and highly addictive psychostimulant which consumption in Europe has been increased over the last years. Several reports have demonstrated that oxidative stress, excitotoxicity, inflammation and mitochondrial dysfunction are some of the neurotoxic features of METH. More recently, it was shown that METH can also compromise the blood-brain barrier (BBB) function and cause cerebral edema. BBB is a structure responsible for protecting the brain from toxic compounds, but nevertheless allows the passage of nutrients and several important molecules into the brain parenchyma. The barrier function is determined by the endothelial cells, that together with pericytes, astrocytes, basal lamina, microglia and neurons form the neurovascular unit. Large water fluxes continuously take place between the different compartments of the brain, as well as between the brain parenchyma and the blood. Disturbances in this well-regulated water homeostasis may have deleterious effects on brain function. Aquaporins (AQPs) are water channels that contribute to water transport across BBB, being AQP4 one of the most important at the Central Nervous System (CNS). AQP4 is express on astrocytic end-feet in contact with brain vessels. Moreover, alterations in AQPs can originate cerebral edema due to abnormally increased water content and consequent brain swelling. Indeed, brain edema has been observed in several neuropathologies, including under conditions of METH consumption. Therefore, the aim of the present work was to investigate if METH induces alterations in the expression of AQP4 and the role of astrocytes against METH-induced toxicity of endothelial cells. Our results show that METH leads to an increase of AQP4 expression in primary cultures of astrocytes, without interfering with the glial fibrillary acidic protein (GFAP) levels. Furthermore, we also tested the effect of the drug in an animal model of METH intoxication (binge paradigm). With this protocol we showed that METH leads to an increase of AQP4 expression in the hippocampus and to a decrease in the frontal cortex, demonstrating that different brain regions present different susceptibilities to METH. However, when the water content of whole brain was measured we did not observe significant alterations. Taking into consideration the role of astrocytes in the BBB function, we further used a mouse brain endothelial cell line (bEnd.3). It was possible to conclude that astrocyte-conditioned medium (ACM) was able to protect endothelial cells (ECs) against METH-induced cell death (3 mM). However, when we exposed the ECs to ACM collected from cells exposed to non-toxic METH concentrations (1 μM and 50 μM), we observed that both ACM METH conditions caused 14 a decreased in the expression of the tight junction proteins (TJs), occludin and claudin-5, without any effect of the ACM control. Overall, our results show that METH causes an increase in AQP4 expression in both primary cultures of astrocytes and in mice hippocampus using an acute METH administration protocol. Moreover, astrocytes in a control situation seem to protect the endothelial cells from METH-induced cell death, but when previously exposed to METH they probably release some factors that negatively interfere with the expression of TJs proteins that ultimately may increase barrier permeability.