Development of 3D cancer cell models for pre-clinical research : evaluation of the tumour microenvironment in 3D stirred-systems

Abstract

Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide. Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the most frequent type of lung cancer, constituting approximately 85% off all lung cancer cases. Despite intensive research for the development of anti-NSCLC drugs, the majority fail in clinical trials. The reasons could be due to absence of therapeutic action and/or due to side effects, which could not be predicted in vitro or in animal studies because they lack the human physiological characteristics. Therefore, it is urgent to develop strategies to eliminate ineffective and unsafe compounds with speed, reliability and respect for animal welfare prior to clinical stages. Preclinical models that can better recapitulate tumour microenvironment features, such as the presence of different cell types (tumour and stromal cells) and extracellular matrix (ECM) components and their 3-dimensional (3D) spatial cellular organization, including cell-cell and cell-ECM interactions, would in principle predict clinical responses with higher accuracy. Tumour stroma is a supportive tissue around the tumour, with fibroblasts being the major cell population. Tumour-stroma crosstalk promotes changes in cancer cells and tumour microenvironment, enabling tumour progression, invasion and metastasis. 3D human cellular models overcome limitations of monolayer drug tests, such as the lack of cell-cell and cell-ECM interactions and 3D spatial cellular organization, better resembling physiological complexity and drug response than 2-dimensional (2D) culture. This allows a wide range of applications in pharmacological studies and in tumour biology since tumour microenvironment can be recapitulated with co-cultures of different type of cells and components, such as the stroma. The aim of this work was to develop scalable and reproducible 3D NSCLC human cellular models that could represent some of the above mentioned features. A 3D culture strategy was followed based on stirred culture systems. In a first approach, aggregation of NSCLC cell lines was implemented in spinner vessels. H460 and H1650 cell lines, representing large cell and bronchioalveolar carcinoma, respectively, formed cellular aggregates in suspension after 3 days of cell culture with high cell viability, cell proliferation and metabolic activity. In a second approach, 3D cell culture in stirred culture systems was combined with an alginate microencapsulation strategy for cell entrapment. H1650 cellular aggregates were encapsulated with and without immortalized normal lung fibroblasts as stromal component (mono and co-cultures, respectively). This strategy enabled to generate homogeneous microcapsules containing tumour cellular aggregates surrounded by fibroblasts, a configuration which resembles the in vivo situation. Moreover, this strategy XII enables collagen accumulation, characteristic of tumour microenvironment, such as ECM proteins production. Microcapsule cultures were maintained in stirred culture systems for 15 days, with high cell viability within aggregates. Cell proliferation and metabolism was similar in mono and co-cultures. Therefore, a 3D human NSCLC cellular model was accomplished, suggesting that the combination of 3D cell cultures, stirred culture systems and microencapsulation technique is a promising tool for the generation of more reliable NSCLC models that better mimic the tumour microenvironment and the possibility to study its influence in tumour progression

O cancro do pulmão é a maior causa de morte por cancro no mundo inteiro. O cancro do pulmão de não-pequenas células (CPNPC) é o tipo de cancro do pulmão mais frequente, constituindo aproximadamente 85% de todos os casos de carcinoma pulmonar. Apesar da investigação intensa para desenvolver fármacos contra este tipo de cancro, a maioria deles não ultrapassa a fase de ensaios clínicos. As razões podem ser devidas à ausência de efeito terapêutico e/ou aos efeitos secundários, que não foram previstos em estudos in vitro nem em estudos animais, uma vez que estes não possuem as características fisiológicas do sistema humano. Deste modo, é urgente eliminar os compostos ineficazes e não seguros com a maior brevidade e eficácia, reduzindo igualmente a experimentação animal. Os modelos celulares humanos 3-dimensionais (3D) superam algumas das limitações dos testes de fármacos em monocamada de células, tais como a ausência de interações célula-célula e a organização celular espacial em 3D, o que melhor mimetiza a complexidade e resposta fisiológica a fármacos, comparando com culturas celulares em 2-dimensões (2D). Os modelos celulares em 3D têm uma vasta aplicação em estudos farmacológicos e na biologia tumoral, uma vez que o microambiente tumoral pode ser mimetizado com co-cultura de diferentes tipos celulares e componentes, como o estroma. O estroma tumoral é um tecido de suporte que existe à volta do tumor, sendo os fibroblastos a maior população celular. Interações tumor-estroma promovem alterações nas células cancerígenas e no microambiente tumoral, permitindo a progressão, invasão e metástases tumorais. O objetivo do trabalho foi desenvolver um modelo celular 3D humano de CPNPC reprodutível e com aplicação em maior escala, com as características 3D descritas anteriormente. Foi usada uma estratégia 3D de cultura celular, baseada em sistemas de cultura agitados. Numa primeira abordagem, agregação de linhas celulares de CPCNP foi implementada. As linhas celulares H460 e H1650, representando carcinomas de grandes células e bronquioalveolar, respectivamente, formaram agregados em suspensão após 3 dias de cultura celular com alta viabilidade e proliferação celular e actividade metabólica. Numa segunda abordagem, cultura celular em 3D em sistemas de cultura agitados foi combinada com uma estratégia de encapsulação em alginato, para confinar as células no mesmo espaço físico. Agregados celulares de H1650 foram encapsulados sem e com fibroblastos do pulmão imortalizados, constituindo o componente estromal (mono- e co-cultura, respectivamente). Esta técnica possibilitou gerar cápsulas com agregados no seu interior e fibroblastos individuais à volta desses agregados, o que se aproxima da situação in vivo. Microcápsulas XIV foram mantidas em sistemas de cultura agitados até 15 dias, com alta viabilidade celular nos agregados. Proliferação e atividade metabólica foi semelhante em mono- e co-cultura. Esta estratégia permite ainda acumulação de colagénio, característica do microambiente tumoral devido à produção de proteínas da matrix extracelular, Assim, foi possível obter um modelo celular 3D humano de CPNPC, o que sugere que a combinação de cultura celular 3D, sistemas de cultura agitados e microencapsulação é uma ferramenta promissora para alcançar modelos celulares mais eficazes que melhor mimetizam o microambiente tumoral e a possibilidade de estudar a sua influência na progressão do tumor