MiRNAs expression profiling and modulation in Glioblastoma Stem Cells

Abstract

Among all brain cancers, glioblastoma multiforme (GBM) is the most common, malignant and lethal type of tumor. Standard treatment consists on the removal of the tumor mass with surgery, followed by chemotherapy and radiotherapy. Despite the recent advances in therapy, the life expectancy of GBM patients after diagnosis is very low. For this reason, new therapeutic approaches for GBM are urgently needed. The discovery of cancer stem cells opens the possibility for new types of therapy. Beyond their capacity for self-renewal and tumorigenesis, these cells are known for their high resistance to radiotherapy and chemotherapy, when compared to other cancer cells. Since these cells can remain in the tissue and form a new tumor even after treatment, it seems essential to develop therapeutic strategies that target cancer stem cells, with the ultimate goal of eradicating the tumor. In this regard, miRNAs have received special attention from the scientific community in recent years. A large number of studies has suggested that miRNAs play important roles in the development of malignant gliomas. Taking this into account, therapies for GBM based on miRNA modulation are a promising field of research. In this study, we proposed to isolate and characterize the glioblastoma stem cell (GSCs) population present in the U87 human glioblastoma cell line. Our results showed that cells isolated from this cell line, using magnetic CD133-microbeads, express nestin and CD133, two well established cancer stem cells markers, and grow in the form of neurospheres in low-adhesion conditions. Our second goal was to compare the miRNA profile of GCSs and other GBM cells and assess the potential of miRNA modulation in the GSCs, with therapeutic purposes. We found that CD133+ and CD133- cells showed different miRNA profiles, especially in what concerns miR-128 expression, since this miRNA was highly downregulated in CD133+ cells. We also evaluated the effect of miR-128 overexpression, alone or in combination with the drug sunitinib, in GBM tumor cell viability. These experiments allowed us to demonstrate that miR-128 overexpression sensitized U87 cells to sunitinib-induced cell death. Since we were unable to deliver miR-128 mimics to the GSC population using commercially available nucleic acid delivery systems, we developed preliminary studies aiming at evaluating the possibility of using stable nucleic acid delivery particles, coupledto the chlorotoxin peptide, to perform miRNA modulation in these cells. We showed that these nanoparticles were able to deliver miRNA mimics to GSCs with high efficiency. Overall, we found evidences that point to an important role of miRNAs in GSC stem properties and that may help to clarify the contribution of these cells to tumor progression, paving the way to the development of new miRNA-based therapeutic strategies for GBM treatment.

Entre todos os tipos de cancro de cérebro, o glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo de tumor mais comum, maligno e letal. O tratamento padrão para este tipo de cancro consiste na remoção do tumor através de cirurgia, seguida de quimioterapia e radioterapia. Apesar dos avanços recentes nas formas de terapia disponíveis para esta doença, a esperança média de vida após o diagnóstico dos pacientes com GBM é muito baixo. Por esta razão, é necessário o desenvolvimento urgente de novas abordagens terapêuticas para GBM. A descoberta da existência de células estaminais cancerígenas abriu a possibilidade para o desenvolvimento de novos tipos de terapia. Para além da sua capacidade de auto-renovação e tumorigénese, estas células são conhecidas pela sua elevada resistência à radioterapia e quimioterapia, quando comparadas com outras células cancerígenas. Uma vez que estas células podem permanecer no tecido e formar um novo tumor, mesmo após o tratamento, parece essencial o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visam a eliminação das células estaminais cancerigenas, com o objetivo final de erradicar o tumor. A este respeito, os miRNAs tem recebido uma atenção especial por parte da comunidade científica nos últimos anos. Um grande número de estudos tem sugerido que os miRNAs podem desempenhar papéis importantes no desenvolvimento do glioblastoma e outros gliomas. Tendo isto em conta, as terapias contra o GBM com base na modulação miRNAs são um campo promissor de pesquisa. O objectivo principal deste trabalho consistiu no isolamento e caracterização da população de GSCs a partir da linha celular de glioblastoma humano U87. Os nossos resultados mostraram que as células isoladas desta linha cellular através do uso de microbeads magnéticas anti-CD133, expressavam nestina e CD133, dois marcadores bem estudados das GSCs, e eram capazes de crescer na forma de neuroesferas, em condições de não aderência. O nosso segundo objetivo passou por comparar o perfil de expressão de miRNAs das GCSs e de outras células de GBM, e avaliar a possibilidade de modulação de miRNAs nas GSC com um propósito terapêutico. As células CD133+ e as células CD133- mostraram diferentes perfis de expressão de miRNAs, especialmente no que diz respeito à expressão do miR-128, que se encontrava significantemente reduzido nas células CD133+. Também foi avaliado o efeito da sobreexpressão do miR-128, sozinho ou em combinação com o fármaco sunitinib na viabilidade das células tumorais de GBM. Estas experiênciaspermitiram-nos demonstrar que o aumento dos níveis do miR-128, por si só ou em combinação com a droga sunitinib, sensibilizaram as células U87 para a morte celular induzida pelo sunitinib. Devido à incapacidade de entregar os oligonucelótidos miméticos do miR-128 à população de GSCs usando sistemas de entrega de ácidos nucleicos comerciais, desenvolvemos estudos preliminares visando avaliar a possibilidade de utilização de partículas estáveis de entrega de ácidos nucléicos, acopladas ao peptideo clorotoxina, para executar a modulação dos miRNAs nestas células. Mostrámos que estas nanopartículas são capazes de entregar os oligonucelótidos miméticos do miR-128 com elevada eficiência. Em conclusão, encontrámos evidências que apontam para um papel importante dos miRNAs nas propriedades estaminais das GSCs e que podem ajudar a esclarecer a contribuição destas células para a progressão do tumor, abrindo o caminho para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para GBM baseadas na modulação de miRNAs.