Neurotensin effect on skin dendritic cells and fibroblasts: repercussions in wound healing and diabetic wound healing

Abstract

A cicatrização de feridas é um processo complexo delineado pelas seguintes fases: homeostase/coagulação, inflamação, migração-proliferação e remodelação. As células da pele são fundamentais no decorrer deste processo, nomeadamente as células de Langerhans (LCs), os mastócitos (MCs), os macrófagos, os queratinócitos, as células endoteliais e os fibroblastos (FBs). Esta dissertação baseou-se no estudo das células LCs e FBs, através do uso da linha celular dendrítica proveniente da pele de fetos de ratinhos (FSDC) e da linha celular de FBs proveniente de recém-nascidos humanos (BJ), em condições normais e inflamatórias in vitro (estimulação através de um lipopolisacarídeo – LPS), num ambiente hiperglicémico (30 mM de glucose). A activação de terminais nervosos sensoriais da pele é igualmente importante para a cicatrização, induzindo a expressão e libertação de neuropeptídeos na pele que se ligam a receptores acoplados a proteínas G das células da pele, modulando a activação de diferentes vias de sinalização. Na presente dissertação é estudado o efeito da neurotensina (NT) na activação das vias de sinalização Akt, cinases de proteínas activada por agentes mitogénicos (MAPK), nomeadamente JNK, p38 e ERK MAPKs, e na activação do factor de transcrição NF-B. O efeito da NT na viabilidade e migração celular, na produção de óxido nítrico (NO), na síntese de citocinas/quimiocinas pro/antiinflamatórias e na expressão de factores de crescimento, também foram avaliadas. Os resultados evidenciaram que os efeitos da NT dependem da sua concentração, do tipo e quantidade de receptores a que se ligam e a célula em que induz efeito. Assim, enquanto 100 nM de NT induziu efeitos pro-inflamatórios, 10 nM de NT induziu efeitos anti-inflamatórios nas células FSDCs; nas células BJ, a NT induziu efeitos anti-inflamatórios de um modo dependente da dose utilizada. A prévia descrição dos efeitos da NT nas células, também abrange condições de inflamação in vitro, nasquais se observou um aumento da síntese da NT nas células FSDCs, não observado nas células BJ, e um aumento da expressão dos receptores de NT nas células BJ, em oposição à sua diminuição nas FSDCs. Por conseguinte, estes resultados evidenciam o papel modelador da NT na inflamação, em que a NT pode ser produzida nas LCs e actuar de um modo parácrino em células da pele, como os FBs. O tratamento das células FSDCs com 10 nM de NT diminuiu a activação das vias inflamatórias NF-B e JNK, a produção de NO, a expressão das citocinas IL-6, TNF-α e IL-10 e o factor de crescimento vascular endotelial (VEGF), assim como activou a via de sobrevivência ERK e aumentou a síntese do factor de crescimento epidermal (EGF). Por outro lado, 100 nM de NT promoveram efeitos opostos. O tratamento das células BJ com 10 ou 100 nM de NT diminuiu a expressão das quimiocinas CCL4, CCL5, CCL11 e IL-8, assim como diminuiu a expressão das citocinas IL-1β e IL-6, de um modo dependente da dose utilizada. NT também induziu a expressão de EGF e promoveu a migração das células BJ. Reduzidas doses de NT modulam negativamente a capacidade imune das células FSDC e BJ, contrastando com o efeito pro-inflamatório de outros neuropeptídeos, como SP e CGRP. O aumento da expressão de EGF, adicionado à diminuição da capacidade imune das células, é importante na inibição da fase inflamatória da cicatrização, e consequente progresso para as fases de migração-proliferação e remodelação. Pelo contrário, altas doses de NT podem promover efeitos patológicos nas células FSDC (estado pro-inflamatório), limitando a progressão da cicatrização. Estes resultados perspectivam o aparecimento de novas terapias para o tratamento da ferida diabética, caracterizada por neuropatia e pro-inflamação, podendo mesmo terminar em úlceras incuráveis nos pés diabéticos (DFUs), com consequente amputação.

Wound healing (WH) is a complex process which involves homeostasis/coagulation, inflammation, migration-proliferation and remodeling. Skin cells like Langerhans cells (LCs), mast cells (MCs), macrophages, keratinocytes, endothelial cells and fibroblasts (FBs) are fundamental to all stages of WH. In the present work, LCs and FBs were studied using a fetal skin dendritic cell line (FSDC) and a cell line obtained from normal newborn human foreskin fibroblasts (BJ), in homeostatic and in vitro inflammatory conditions, stimulated by lipopolysaccharide (LPS), and under a hyperglycemic (30 mM of glucose) environment. The activation of sensory nerve endings of the skin is also important in WH, inducing the expression and release of neuropeptides into the skin that bind to G-protein coupled receptors in skin cells and modulate the activation of different signaling pathways. This work shows the effects of the neuropeptide neurotensin (NT) in the activation of the intracellular signaling pathways of Akt, Mitogen-activated protein kinases (MAPK) (JNK, p38 and ERK) and the transcription factor NF-B. Moreover, the effect of NT on cell viability and migration, nitric oxide (NO) production, synthesis of pro- and anti-inflammatory cytokines/chemokines and expression of growth factors was also evaluated. The results showed that NT effects were dependent on NT concentration, on the type and amount of receptors that bind to NT and, consequently, on the host cells. Accordingly, while NT induced a pro (100 nM) or anti-inflammatory (10 nM) effect in FSDCs, in BJ cells, NT only induced a dose-response anti-inflammatory effect. NT also promoted its effects in in vitro inflammatory conditions. In addition, NT synthesis was upregulated in FSDCs and barely synthesized in BJ cells, as well as, NT receptors were downregulated in FSDCs and upregulated in BJ cells, in inflammatory conditions.These results enlighten that NT is an essential mediator of inflammation, produced by LCs to act in a paracrine way in surrounding cells, like FBs. NT (10 nM) treatment downregulated the inflammatory pathways of NF-B and JNK, the production of NO, the expression of the acute-phase proteins IL-6 and TNF-α, the anti-inflammatory cytokine IL-10 and the vascular endothelial growth factor (VEGF), while the survival pathway ERK and the epidermal growth factor (EGF) were upregulated in FSDCs. However, NT (100 nM) upregulated NO production and the expression of acute-phase proteins, while downregulated the expression of EGF. BJ cells treated with NT (10 or 100 nM) also downregulated the expression of pro-inflammatory chemokines, namely CCL4, CCL5, CCL11 and IL-8, as well as, the expression of pro-inflammatory cytokines, like IL-1β and IL-6, in a dose-dependent way. NT also induced the expression of EGF and promoted the migration of BJ cells. Low doses of NT negatively modulated the immune capacity of FSDCs and BJ cells, in contrast to other neuropeptides effects, like SP and CGRP that induce a proinflammatory status. In addition to this negative immunomodulation, the expression of EGF increases, important in the downregulation of the inflammatory phase of WH and promotion of the migration-proliferation and remodeling phases of WH. In contrast, high doses of NT may promote pathological effects in FSDCs (pro-inflammatory state), limiting the promotion of WH. These results may give new perspectives in the design of new therapies for diabetic wound healing, a disease characterized by neuropathy and a pro-inflammatory environment that can culminate into incurable diabetic foot ulcerations (DFUs) or even foot amputation.