Ketone Bodies as Brain Substrates

Abstract

Since their discovery as a marker for diabetic ketoacidosis, ketone bodies have become known for their therapeutic role as effective agents in refractory epilepsy and a diet specifically designed to increase ketone bodies’ levels in circulation has been often prescribed as treatment. In the classical ketogenic diet, intake of even small additional amounts of carbohydrates drastically drops the level of circulating ketone bodies and abolishes their therapeutical effects (in epilepsy, the immediate re-appearance of seizures is the most obvious sign of reversal). Novel dietary supplements have been developed to produce ketone bodies under less restrictive dietary conditions and are able to generate a significant amount of ketone bodies even in the presence of considerable dietary carbohydrate. Since previous studies of cerebral ketone body utilization had always been performed under conditions of low glucose availability, the aim of this project was to evaluate the competition between glucose and ketone bodies for cerebral energy production with saturating concentrations of both substrates and probe for possible cell-type substrate preference. Thus, we evaluated the contribution of saturating (5mM) levels of the ketone body 3hydroxybutyrate (3HB) to cerebral energy generation in the presence of non-limiting glucose levels (5mM) in hippocampal slices. Following administration of selectively 13C-enriched exogenous glucose, ketone bodies and lactate/pyruvate, we used 13C-NMR isotopomer analysis of tissue glutamate and GABA to determine the contribution of each substrate to glutamatergic and GABAergic Krebs cycle utilization. We demonstrated that 3HB effectively competed with glucose for acetyl-coA formation in both metabolic compartments, but with greater efficacy in the glutamatergic compared to the GABA-ergic compartment. 3HB did not decrease lactate/pyruvate utilization for Krebs cycle oxidation, suggesting that it did not downregulate pyruvate oxidation to acetyl-coA via pyruvate dehydrogenase. Instead, it may downregulate glycolysis upstream of PDH, a hypothesis supported by the observation that levels of superfusate lactate derived from glycolysis of the 13C-enriched glucose substrate showed a strong tendency to be reduced in the presence of the ketone body. Ketone bodies also seem to contribute to a more reduced cytosolic redox state as revealed by higher tissue lactate/alanine ratios when 3HB was included as a substrate. Brain slice preparations also secreted a significant amount of acetate into the superfusion medium. All four possible isotopomers of acetate ([1-13C], [2-13C], [U-13C] and [U-12C]acetate) were resolved by 1H NMR of superfusate samples. Acetate 13C-isotopomers originating from [113C]glucose, [U-13C]glucose, [3-13C]lactate and [2-13C]lactate/pyruvate were observed, but in experiments where [U-13C]3HB was present, its predicted [U-13C]acetate product was never detected. Hence, we conclude that this acetate was derived from a metabolic pool that was not in exchange with acetyl-CoA that was derived from 3HB oxidation. While not contributing any carbons to secreted acetate, the presence of 3HB seemed to attenuate its production. Further experiments are needed to identify the enzymes and cell compartments that are involved in its production.

Desde a sua descoberta como um marcador de cetoacidose diabética, os corpos cetónicos tornaram-se conhecidos pelo seu papel terapêutico em epilepsia refractária, e uma dieta desenhada especificamente para aumentar os níveis de corpos cetónicos em circulação tem sido prescrita como tratamento. Na dieta cetogénica clássica, o consumo de pequenas quantidades de hidratos de carbono diminui drasticamente os níveis de corpos cetónicos em circulação e suprime o seu efeito terapêutico (em pacientes epilépticos, o re-aparecimento imediato das convulsões é o sinal mais óbvio de reversão). Têm sido desenvolvidos novos suplementos dietéticos para produzir corpos cetónicos sob condições alimentares menos restritas, e estes são capazes de gerar uma quantidade significativa de corpos cetónicos mesmo na presença de níveis de carbohidratos consideráveis. Dado que os estudos prévios sobre a utilização cerebral de corpos cetónicos foram sempre realizados com baixa disponibilidade de glucose, o objectivo deste trabalho foi o de avaliar a competição entre glucose e corpos cetónicos para a produção de energia cerebral em condições saturantes de ambos os substratos, e explorar possíveis preferências ao nível de tipo de célula. Assim, avaliámos a contribuição de concentrações saturantes (5mM) do corpo cetónico 3hidroxibutirato (3HB) para a produção energética cerebral na presença de níveis de glucose nãorestritivos (5mM) em fatias de hipocampo. Após a administração de glucose, lactato/piruvato e corpos cetónicos selectivamente marcados com 13C, analisámos os isotopómeros de glutamato e GABA por 13C-RMN para determinar a contribuição de cada substrato para a oxidação no ciclo de Krebs nos neurónios glutamatergicos e GABAérgicos, respectivamente. Demonstrámos que o 3HB compete eficazmente com a glucose para a formação de acetil-coA em ambos os compartimentos, mas com maior eficácia no compartimento glutamatérgico, quando comparado com o compartimento GABAérgico. O 3HB não diminuiu a utilização de lactato/piruvato pelo ciclo de Krebs, sugerindo que não diminui a oxidação do piruvato a acetil-coA via piruvato desidrogenase. Em vez disso, poderá diminuir o fluxo glicolítico acima da pirvato desidrogenase, uma hipótese suportada pela observação de que os níveis de lactato proveniente da glucose marcada no superfusato mostram uma forte tendência para serem mais baixos na presença do corpo cetónico. Os corpos cetónicos também parecem contribuir para um estado citosólico mais reduzido, demonstrado pelo maior rácio lactato/alanina observado quando o 3HB era incluído como substrato. As fatias de estruturas cerebrais também parecem excretar uma quantidade significativa de acetato para o meio superfusato. Todos os isotopómeros possíveis do acetato ([1-13C], [2-13C], [U-13C] e [U-12C]acetato) foram determinados no superfusato por 1H RMN. Foram observados os isotopómeros de 13C de acetato proveniente de [1-13C]glucose, [U-13C]glucose, [3-13C]lactato e [213C]lactato/piruvato mas nas experiências em que [U-13C]3HB estava presente, o esperado [U13C]acetato nunca foi observado. Deste modo, concluímos que este acetato é formado de um compartimento metabólico que não está em contacto com o acetil-coA derivado da oxidação de 3HB. Ainda que não contribuindo para a formação de acetato, a presença do 3HB pareceu atenuar a sua produção. Serão necessárias mais experiências para identificar as enzimas e compartimentos celulares envolvidos na produção de acetato.