Modulation of pro-inflammatory respondes in the retina by neuropeptide Y: the role of NPY Y1 receptor

Abstract

Neuropeptide Y (NPY) is a 36 amino acid peptide that is abundantly distributed in the central nervous system (CNS), including the retina. NPY acts through the activation of several G protein-coupled receptors: Y1R, Y2R, Y4R and Y5R. It has been shown that this peptide has neuromodulatory and neuroprotective roles in the retina, and it has been associated with physiological and pathological conditions. Increasing evidence has shown that NPY is a regulator of inflammatory processes, but its effects depend on cell types and tissues, the type of NPY receptors involved and on factors present in the cellular milieu. However, little is known about its potential inhibitory effects on pro-inflammatory processes in the retina, especially controlling retinal microglia reactivity. Microglia are the innate immune cells of the CNS and are involved in the maintenance of retinal homeostasis. However, in response to retinal injury, activated microglia adopt ameboid morphology, express inducible nitric oxide synthase (iNOS) and release neurotoxic factors such as the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6, and reactive oxygen species (ROS), which can lead to neuronal degeneration. The detrimental effects of overactivated microglia are thought to contribute to the pathogenesis retinal degenerative diseases, such as diabetic retinopathy and glaucoma. Since neuroinflammation is described to be involved in the pathogenesis of several retinal degenerative diseases, we investigated the NPY effects, particularly via the Y1R activation, on the modulation of microglia activation and inhibition of pro-inflammatory processes in the retina. To induce an inflammatory response, cultured retinal explants, primary retinal neural mixed cultures and purified cultures of retinal microglial cells were exposed to lipopolysaccharide (LPS), in the absence or presence of NPY or a Y1 receptor agonist ([Leu31, Pro34]-NPY) and/or antagonist (BIBP3226). Additionally, an animal model of retinal degeneration, a retinal ischemia-reperfusion (I/R) injury model, was used. In this case, NPY or [Leu31, Pro34]-NPY (LP-NPY) were injected intravitreally 1 h before ischemia and retinal blood flow was restored for 8 h or 24 h. Several markers and parameters of the retinal inflammatory status were evaluated, including the activation of retinal microglial cells, in terms of changes in morphology and inducible protein expression, as well as the expression and production of pro-inflammatory cytokines in the retina. In cultured retinal explants, NPY was able to inhibit the alterations in retinal microglia morphology, as well as the increase in iNOS expression and ROS production in retinal microglia, triggered by LPS. Moreover, NPY inhibited IL-1β and IL-6 expression and production. Y1R activation mimicked the inhibitory effects of NPY on the LPS-induced alterations in retinal microglia morphology and iNOS expression. In addition, activation of Y1R inhibited the expression and production of all pro-inflammatory cytokines studied (TNF- α, IL-1β and IL-6), indicating that Y1R appears to have a predominant role on the effects mediated by NPY. In the I/R injury model, intravitreal injection of NPY or LP-NPY before ischemia inhibited morphological changes in retinal microglia induced by I/R 24 h after reperfusion. Furthermore, 8 h after reperfusion the upregulation of TNF-α, IL-1β and IL-6, and the production of TNF-α and IL-6, in ischemic retinas, was inhibited by NPY. Altogether, these data provide evidence that NPY and Y1R activation are able to regulate retinal microglia activation and inhibit the expression and production of neurotoxic factors in the retina. Immunohistochemistry data and in vitro studies indicate that retinal microglial cells primarily express iNOS and are the primary sources of ROS production under pro-inflammatory conditions in the retina. These findings could point novel physiological and therapeutic roles of NPY system in neuroinflammation, not only in the retina, but also in the nervous system.

O neuropeptídeo Y (NPY) é um peptídeo com 36 aminoácidos que se encontra amplamente distribuído no sistema nervoso central (SNC), incluindo a retina. Os seus efeitos são mediados através da ativação de vários recetores acoplados a proteínas G: Y1R, Y2R, Y4R e Y5R e y6R. Este peptídeo pode atuar como neuromodulador e neuroprotetor na retina, e tem sido associado a diversas doenças e processos fisiológicos. Evidências crescentes têm demonstrado que o NPY é um regulador de processos inflamatórios, dependendo os seus efeitos do tipo de tecidos e células em que atua, do tipo de recetores envolvidos e dos fatores presentes no meio. No entanto, o seu potencial papel antiinflamatório na retina, em particular no controlo da reatividade da microglia, é praticamente desconhecido. As células da microglia são células do sistema imunitário do SNC, e têm um papel na homeostase da retina. No entanto, em resposta a lesões na retina, as células da microglia ficam ativadas, adotando uma morfologia ameboide, expressam a isoforma indutível da sintase do monóxido de azoto (iNOS), libertam substâncias neurotóxicas, como por exemplo as citocinas pró-inflamatórias TNF-, IL-1 e IL-6, e espécies reativas de oxigénio (ROS), o que pode contribuir para a morte neuronal. Pensa-se que os efeitos nocivos da microglia ativada podem contribuir para a patogénese de doenças degenerativas da retina, tais como a retinopatia diabética e o glaucoma. Uma vez que se considera que a neuroinflamação está envolvida na patogénese de várias doenças da retina, neste trabalho investigou-se os efeitos do NPY, e em particular da ativação do recetor Y1 (Y1R), na modulação da ativação da microglia e na inibição da resposta pro-inflamatória na retina. Para induzir uma resposta inflamatória, expuseram-se culturas de explantes de retina, culturas mistas de retina e culturas purificadas de microglia de retina a lipopolissacarídeo (LPS), na ausência ou presença de NPY ou de um agonista ([Leu31, Pro34]-NPY) e/ou antagonista (BIBP3226) do Y1R. Adicionalmente, foi utilizado um modelo animal de isquémiareperfusão (I/R) da retina. Neste caso, o NPY ou o [Leu31, Pro34]-NPY (LP-NPY) foram injetados no vítreo 1 h antes da isquémia, tendo sido utilizados dois tempos de reperfusão, 8 e 24 h. Foram avaliados diversos marcadores e parâmetros indicadores de inflamação na retina, incluindo o estado de ativação das células da microglia, em termos de alterações morfológicas, assim como a expressão e produção de citocinas pro-inflamatórias. Em culturas de explantes de retina, o NPY inibiu as alterações na morfologia das células da microglia, bem como o aumento da expressão de iNOS e a produção de ROS na microglia de retina, desencadeados pela exposição a LPS. Por outro lado, o NPY inibiu a expressão e produção de IL-1β e IL-6. A ativação do Y1R mimetizou os efeitos do NPY na inibição das alterações morfológicas e expressão de iNOS na microglia de retina induzidas pelo LPS. Além disso, a ativação do Y1R inibiu a expressão e produção de todas as citocinas pró-inflamatórias estudadas (TNF-α, IL-1β e IL-6), sugerindo um papel importante para o Y1R nos efeitos mediados pelo NPY. No modelo de I/R, a injeção intravítrea de NPY ou de LP-NPY antes da isquémia inibiu as alterações morfológicas nas células da microglia de retina induzidas pela I/R após 24 h de reperfusão. Além disso, após 8 h de reperfusão, o aumento na expressão de TNF-α, IL-1β e IL-6 e na produção de TNF-α e IL-6 em retinas sujeitas a isquémia foi inibido pelo NPY. No seu conjunto, os dados obtidos revelam que o NPY e a ativação do Y1R são capazes de regular a ativação da microglia de retina e inibir a expressão e produção de fatores neurotóxicos na retina. Estes resultados poderão contribuir para elucidar potenciais efeitos fisiológicos e terapêuticos do NPY em processos neuroinflamatórios não somente na retina, mas também no sistema nervoso.