Assessment of the effect of nucleolin expression on the phenotype of breast cancer cells

Abstract

O cancro da mama é um dos tipos de cancro mais diagnosticado em todo o Mundo e a principal causa de morte associada com cancro, em mulheres. Apesar do elevado número de casos diagnosticados devido ao desenvolvimento de técnicas para deteção precoce, mortes de doentes com cancro da mama continuam associadas ao desenvolvimento de resistência à quimioterapia e, consequentemente, formação de metástases. Para combater estas evidências, é importante desvendar os mecanismos moleculares por detrás da iniciação, expansão e metastização do cancro da mama. A nucleolina é uma proteína envolvida na proliferação celular, ligação ao ADN, ARN e proteínas, estando envolvida na regulação genética, replicação e recombinação de ADN, metabolismo de ARN, transcrição e sinalização celular. A nucleolina está sobrexpressa em células cancerígenas, incluindo células estaminais de cancro da mama, e células endoteliais de vasos tumorais angiogénicos. Devido ao elevado reconhecimento da sua importância, a nucleolina à superfície da célula tem sido estudada como um possível alvo para terapias anticancerígenas, com diversas moléculas em desenvolvimento contra células cancerígenas humanas. De acordo com a literatura, neste trabalho formulou-se a hipótese de que a nucleolina pode funcionar como um proto-oncogene em células de cancro da mama, ao modular propriedades estaminais. Para uma melhor compreensão de como a expressão de nucleolina afeta as células de cancro da mama, foi desenvolvida uma nova ferramenta molecular para modular a expressão de nucleolina em células de mamífero. O silenciamento de nucleolina foi conseguido usando um shRNA num sistema lentiviral e a sua sobrexpressão usando um sistema lentiviral induzível. Transdução dos lentivíruses nas linhas celulares humanas de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231 permitiu estabelecer linhas celulares estáveis geneticamente modificadas, expressando diferentes níveis de nucleolina. Validação in vitro destes sistemas permitiu confirmar o silenciamento e sobrexpressão da nucleolina. O silenciamento da nucleolina levou a uma diminuição da capacidade migratória de ambas as linhas celulares de cancro da mama, MCF-7 e MDA-MB-231, em aproximadamente 2 vezes e 3,3 vezes relativo aos correspondentes controlos de células não transduzidas, respetivamente. Ensaios in vitro usando estas linhas celulares sugeriram que a nucleolina poderá ter impacto nas características carcinogénicas de células de cancro da mama

Breast cancer is one of most common cancer diagnosed worldwide and the leading cause of cancer-related deaths among women. Despite the high rate of diagnosis owed to the advancement of techniques for early detection, breast cancer death remains associated with chemotherapy resistance and, hence, development of metastasis. To counteract these facts, it is important to unravel the molecular mechanisms behind breast cancer initiation, expansion and metastasis. Nucleolin plays important roles in cell proliferation, binding to DNA, RNA and proteins, enabling the regulation of gene expression, DNA replication and recombination, RNA metabolism, transcription and signal transduction. Nucleolin is overexpressed in cancer cells, including putative breast CSC, and endothelial cells of angiogenic tumour vessels. Owed to the growing recognized importance, surface nucleolin is being exploited as a target for anti-cancer strategies, with several molecules in development against human cancers. Accordingly, in this work it is hypothesized that nucleolin may function as an oncogenic driver of breast cancer, upon modulating stemness properties. For a better understanding on how modulation of nucleolin expression affects breast cancer cells feature, a novel molecular tool was developed, aiming at modulating nucleolin expression in mammalian cells. Nucleolin silencing was accomplished using a lentiviral shRNA approach and nucleolin-overexpression using an inducible lentiviral system. Transduction of the lentiviruses in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines allowed to establish genetically modified stable cell lines, to expressing different levels of nucleolin. Further in vitro validation of the systems was performed, confirming the knockdown and overexpression of nucleolin. Nucleolin downregulation decreased the migration capacity on both MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines in approximately 2-fold and 3.3-fold, respectively, relative to the corresponding non-transduced control. In vitro assays using this cell lines suggested that nucleolin might have an impact in the carcinogenic feature of breast cancer cells.