Influência da Radiação gama no comportamento celular de scaffolds desenhados para Medicina Dentária

Abstract

A Engenharia de Tecidos, um campo do saber em grande crescimento, tem vindo a dar contributos de grande valor na área de Medicina Regenerativa, visando substituir tecidos humanos e promover a sua regeneração. Uma das estratégias mais utilizadas atualmente é a aplicação de scaffolds.A caraterística mais importante de um material para este tipo de aplicações é a biocompatibilidade, habilidade de um material em ser compatível com tecidos vivos, em especial, o corpo humano. Materiais biocompatíveis são desenvolvidos especificamente em função da aplicação a que se destinam e têm de obedecer a um amplo espectro de parâmetros.Os scaffolds estudados neste trabalho foram produzidos usando um processo de fabricação aditiva, usando uma bioextrusora desenvolvida pelo Instituto Politécnico de Leiria. A poli(caprolactona) foi o material base utilizado, sozinho, ou combinado com hidroxiapatite, em duas diferentes percentagens (10 e 25%) de origem natural ou sintética, cuja adição visa potenciar a bioatividade do biomaterial e reforçar a estrutura. O objetivo principal deste trabalho é comparar a esterilização de scaffolds para regeneração óssea por radiação gama, com a esterilização por óxido de etileno, o método mais utilizado para material médico. Com este intuito, foi testado o seu comportamento biológico, através de ensaios in vitro e in vivo. Foi avaliada a citotoxicidade e proliferação celular usando macrófagos e fibroblastos, isolados e em co-cultura. A esterilização por radiação gama foi efetuada pelo Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares do Instituto Superior Técnico de Lisboa. Foi usada uma dose média de aproximadamente 25 kGy. Já a esterilização por óxido etileno foi feita no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, de acordo com o protocolo de rotina para material cirúrgico.Os ensaios in vitro foram realizados com fibroblastos, macrófagos e com a sua co-sultura. Os fibroblastos foram desenvolvidos a partir da polpa e papila radical de dentes jovens, através de uma colaboração com a área de Endodontia do Departamento de Estomatologia, Medicina Dentária e Cirurgia Maxilo-Facial da Faculdade de Medicina da Faculdade de Coimbra. Usaram-se macrófagos peritoneais de rato, colhidos pela equipa, uma vez que possuem caraterísticas muito semelhantes aos macrófagos humanos.Para avaliar o desempenho dos scaffolds in vitro, utilizou-se o MTT (brometo de 3-(4,5,-dimetiltiazol-2-il)-difenil tetrazólio), um método colorimétrico que permite avaliar a viabilidade celular por comparação direta de absorvância.Foram também realizadas experiências in vivo, usando ratos Wistar (modelo animal escolhido). Nestes foram implantadas cirurgicamente pequenas amostras dos scaffolds de modo a avaliar o seu comportamento biológico. No decorrer das experiências foram cumpridas todas as normas nacionais e internacionais de experimentação animal.

Tissue Engineering, a rapidly growing field of knowledge, has been giving great contributions to the area of Regenerative Medicine. Aiming to replace human tissues and promote their regeneration, nowadays one of the most commonly used strategies is the use of scaffolds.The most important feature for a material with this type of applications is its biocompatibility, the material’s ability to be compatible with living tissues, especially the human body. Biocompatible materials are developed specifically for an intended application, and have to comply with a wide variety of parameters.The scaffolds were produced using an additive manufacturing process with a bio-extruder, developed by the Instituto Politécnico de Leiria. Poly(caprolactone) was the base material, used alone or combined with hydroxyapatite in two different percentages (10 and 25%), of natural and synthetic nature. The addition of hydroxyapatite intends to enhance the bioactivity of the biomaterial and to reinforce the structure.The main goal of this work is to compare the sterilization of scaffolds for bone regeneration by gamma radiation versus ethylene oxide sterilization, the most widely used method for medical material. To this purpose, their biological behavior has been tested through in vitro and in vivo assays. The cytotoxicity and cell proliferation of isolated macrophages, fibroblasts, and their co-culture has been evaluated.Sterilization by gamma radiation was performed in collaboration with the Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares do Instituto Superior Técnico de Lisboa. An average dose of approximately 25 kGy was used. The ethylene oxide sterilization was performed at the Hospital and University Center of Coimbra, according to their routine protocol for surgical material.The assays were performed with fibroblasts, macrophages and their co-culture. Fibroblasts were developed from dental pulp and apical papilla of immature teeth, obtained through a collaboration with Endodontics of the Dentistry Department of the Medical School of the University of Coimbra Peritoneal rat macrophages were collected by the team, as the present similar characteristics to human macrophages.In vitro, MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-diphenyl-tetrazolium bromide) was the chosen method to evaluate the biological performance of scaffolds; this colorimetric assay enables the cell proliferation evaluation by direct absorbance comparison..In vivo experiments were also performed using Wistar rats (experimental animal model). Small samples of the scaffolds were implanted surgically in order to evaluate their biological behavior. All national and international standards of animal experimentation were fulfilled.