Nanoparticles-in-thermosensitive enemas as novel rectal anti-HIV microbiocides

Abstract

Os microbicidas de base nanotecnológica poderão desempenhar um papel importante na prevenção na transmissão sexual do VIH. No entanto, apesar do seu potencial, os nanossistemas microbicidas requerem ser incorporados em formas farmacêuticas de modo a constituir produtos tangíveis, nomeadamente para administração retal. Os enemas termossensíveis são formulados como sistemas líquidos à temperatura ambiente mas que sofrem uma transição sol-gel a um pouco menos do que 37 ºC, formando assim sistemas semi-sólidos tais como géis. O seu estado líquido inicial poderá aumentar a distribuição dos nanossistemas ao longo da mucosa logo após administração retal, enquanto que a sua posterior gelificação poderá promover uma permanência prolongada no colorreto. De modo a testar esta possibilidade, foram desenvolvidos neste trabalho enemas termossensíveis baseados em poloxâmero 407 para serem ustilizados como veículos para a administração retal de potenciais nanotransportadores de fármacos microbicidas, nomeadamente nanopartículas (NPs) de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA). O estudo dos enemas incluiu a determinação das suas propriedades tecnológicas mais relevantes, nomeadamente a temperatura e tempo de transição sol-gel, características reológicas, pH e osmolalidade, bem como ensaios de citotoxicidade in vitro através da execução de ensaios de redução do MTT e de libertação da LDH. Um enema termossensível carregado com NPs (NPs-in-thermo) otimizado foi ainda testado num estudo preliminar quanto à sua distribuição e retenção in vivo num modelo de murganho.Foram preparadas diferentes formulações de enemas termossensíveis pelo método a frio. A concentração e o lote do poloxâmero 407 utilizados tiveram um grande impacto na transição sol-gel e viscosidade dos enemas, enquanto que a incorporação de excipientes como a glicerina e o ácido sórbico, respectivamente, influenciaram a osmolalidade e o pH. Foi selecionada uma base para enema termossensível otimizada com a composição de 15% (w/v) em poloxâmero 407 e 2% (w/v) em glicerina num tampão fosfato 10 mM e a pH final de 7,0 para incorporação de NPs de PLGA (170-200 nm) obtidas por nanoprecipitação com concentrações de 0,1 a 1% (m/v). Os NPs-in-thermo obtidos possuiam valores de temperatura e tempo de transição sol-gel de 27-31 ºC e 1,6-2,2 min, respetivamente, viscosidade de 0,0021-0,0031 Pa s (20 ºC) ou 2,0-2,6 Pa s (37 ºC) a uma taxa de cisalhamento de 40 s-1, pH de 6,9-7,2 e osmolalidade de 348-470 mOsm/Kg. A citotoxicidade dos NPs-in-thermo revelou-se baixa quando determinada em células colorretais Caco-2 e por comparação com produtos lubrificantes comerciais. A análise de imagens de fluorescência no infravermelho próximo, captadas in vivo e ex vivo em murganhos e os seus respetivos tecidos colorretais, mostrou que NPs fluorescentes incorporadas no enema termossensível à concentração de 0,5% (p/v) podem ser localizadas com sucesso após a sua administração retal. Para além disso, os dados preliminares obtidos sugerem que a utilização do NPs-in-thermo promove uma menor distribuição inicial mas uma retenção mais prolongada das NPs ao nível colorrectal, nomeadamente quando comparado com a administração das mesmas NPs num veículo líquido (solução tampão fosfato salino a pH 7,0). Em conclusão, o NPs-in-thermo otimizado neste trabalho poderá constituir uma plataforma interessante para a administração retal de fármacos microbicidas anti-VIH.

Nanotechnology-based microbicides may play a relevant role in preventing sexual HIV transmission. However, despite their potential, microbicide nanosystems require to be incorporated into suitable dosage forms in order to constitute tangible products, namely for rectal use. Thermosensitive enemas can be designed as liquids at room temperature that undergo sol-gel transition at just below 37 ºC, thus forming semi-solid systems such as gels. Their initial liquid state may enhance distribution of nanosystems throughout the mucosa upon rectal administration, while subsequent jellification may prolong local residence. In order to attest this possibility, thermosensitive enemas based on poloxamer 407 were developed in this work as vehicles for the rectal administration of surrogate microbicide drug nanocarriers, namely poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)-based nanoparticles (NPs). Enemas were studied for relevant technological features including sol-gel transition temperature and time, rheological properties, pH and osmolality, as well as for in vitro cytotoxicity using the MTT reduction and LDH release assays. An optimized NPs-in-thermosensitive enema (NPs-in-thermo) was further assessed for in vivo distribution and retention in a preliminary study using a mouse model.Different thermosensitive enema formulations were obtained using the cold method. The concentration and batch of poloxamer 407 had the most impact on sol-gel transition and viscosity, while the incorporation of excipients such as glycerin and sorbic acid impacted osmolality and pH, respectively. An optimized thermosensitive enema base comprising 15% (w/v) poloxamer 407 and 2% (w/v) glycerin in 10 mM phosphate buffer at a final pH of 7.0 was considered for incorporating 0.01-1% (w/v) of PLGA-based NPs (170-200 nm) obtained by nanoprecipitation. The NPs-in-thermo featured mean values of sol-gel transition temperature and time of 27-31 ºC and 1.6-2.2 min, respectively, viscosity of 0.0021-0.0031 Pa s (20 ºC) or 2.0-2.6 Pa s (37 ºC) at a shear rate of 40 s-1, pH of 6-9-7.2 and osmolality of 348-470 mOsm/kg. Cytotoxicity of NPs-in-thermo to Caco-2 colorectal cells was shown to be low, namely when compared to commercial lubricant products. In vivo and ex vivo near infrared fluorescence imaging of mice and colorectal tissues, respectively, showed that fluorescent NPs incorporated into thermosensitive enemas at 0.5% (w/v) could be successfully tracked upon rectal administration. Moreover, preliminary data suggest that the use NPs-in-thermo mildly reduced initial distribution but prolonged retention of NPs at the colorectum as compared to NPs administered in a liquid vehicle (phosphate buffered saline, pH 7.0). In conclusion, the NPs-in-thermo proposed and optimized in this work may constitute an interesting platform for the rectal delivery of anti-HIV microbicide drug candidates.