Desenvolvimento de entidades químicas inovadoras para superar o desafio da resistência antimicrobiana

Abstract

O desenvolvimento de novos tratamentos eficazes contra doenças infeciosas constitui um dos maiores desafios da Química Medicinal na atualidade e, certamente, também no futuro. Dada a relevância da problemática mencionada, o objetivo central do trabalho apresentado nesta Tese consiste no design, síntese e desenvolvimento de novas entidades químicas antimicrobianas com mecanismos de ação alternativos, de modo a contribuir para superar este desafio. Neste sentido, o trabalho foi dividido em duas áreas clínicas de intervenção: as infeções tópicas causadas por bactérias e as infeções causadas por protozoários. No capítulo 1 apresenta-se uma revisão crítica e minuciosa da literatura subjacente aos diferentes tópicos e às famílias de compostos químicos com atividade antimicrobiana abordados nos capítulos seguintes. Adicionalmente, são também apresentados os objetivos do trabalho desenvolvido. Relativamente ao tratamento de doenças infeciosas provocadas por bactérias, no capítulo 2 descreve-se a síntese de novos fotossensibilizadores que possam ser aplicados numa terapia ativada pela luz (aPDT). O trabalho desenvolvido neste capítulo foca-se em três diferentes famílias: I - macrociclos tetrapirrólicos neutros (sulfonamido-porfirinas e sulfonamido-bacterioclorinas); II - macrociclos tetrapirrólicos catiónicos do tipo imidazolil-porfirinas e III - macrociclos pirrólicos do tipo (sub)ftalocianina. A família I foi baseada em moléculas bimodais, contendo na sua estrutura porfirinas neutras e sulfonamidas, compostos com atividade antibacteriana reconhecida. Neste capítulo descreve-se a síntese seletiva de compostos mono-substituídos e tetra-substituídos derivados da TPFPP por substituição com a metanosulfonamida, em concentrações de reação controladas, assim como as respetivas bacterioclorinas com bons rendimentos (70-90%). A família II centrou-se em fotossensibilizadores porfirínicos catiónicos derivados de 1-metilimidazol. Neste, foram exploradas rotas sintéticas para obter eficientemente meso-tetra-imidazolil-porfirinas simétricas e meso-di-imidazolil-porfirinas não-simétricas, compostos com esqueleto semelhante, mas com diferentes propriedades lipofílicas, pesos moleculares, número e distribuição de carga, cujos efeitos foram avaliados na atividade antibacteriana. No decurso da síntese da porfirina meso-tetra-imidazolil (2.6), foram efetuadas otimizações dos procedimentos sintéticos com recurso ao método por utilização do método de água/Mw, que permitiu diminuir o tempo de reação e aumentar a sustentabilidade do processo tendo-se obtido com bons rendimentos. Realizou-se a cationização de 2.6, tendo obtido a porfirina 2.7 e posteriormente o complexo de zinco (II) 2.8. A porfirina base da família das meso-di-imidazolil-porfirinas não-simétricas 2.9 foi sintetizada mediante uma condensação [2+2], seguida de oxidação, sendo obtida com um rendimento de 19%. De seguida sintetizou-se o complexo de zinco (II) 2.10 e consequente cationização, obtendo-se a porfirina 2.11. A família III foi baseada em ftalocianinas e subftalocianinas, pelo que se começou pela modulação dos precursores de ambos os compostos, ftalonitrilos, com grupos passíveis de serem cationizados. De seguida, procedeu-se à síntese eficiente de metaloftalocianinas de Zn (II) e posteriormente à preparação de subftalocianinas com os mesmos grupos. As subftalocianinas aminadas apresentaram baixa estabilidade química, coeficientes de absorção molar relativamente baixos, sem possibilidade de serem cationizadas. Consequentemente, não se prosseguiu com o desenvolvimento desta família. No capítulo 3, foi feita a caracterização fotofísica e fotoquímica dos compostos sintetizados e foram realizados estudos biológicos em bactérias planctónicas e biofilmes e em células eucarióticas. Os resultados mais promissores foram observados para a família II, observando-se uma boa capacidade de absorção de luz (log ε =5,31-4,29), razoável capacidade formação de ROS (ɸΔ= 0,18-0,75) assim como uma elevada fotoestabilidade (ɸPd= 4x10–5 e 8x10–6 para 2.8 e 2.11, respetivamente). De seguida, realizaram-se estudos de fotoinactivação de bactérias planctónicas, observando-se uma inativação bacteriana extremamente elevada para o fotossensibilizador 2.8, com maior peso molecular, quatro cargas positivas e metal central zinco (II), inativando bactérias de todas as estirpes com 1000 e 100 nM (redução de 7 log10 UFCs). Estes resultados promissores conduziram-nos à realização de estudos em bactérias multirresistentes coletadas de pacientes do Hospital da Universidade de Coimbra. Os graus de inativação obtidos foram elevados, sendo que o PS 2.8 demonstrou capacidade para inativar todas as estirpes usando uma concentração de apenas 1 µM, demonstrando a premissa original de que a aPDT tem potencial para ser aplicada com sucesso em estirpes com resistência aos antibióticos atuais. Deste modo, prosseguimos com a avaliação em biofilmes da estirpe S. aureus ATCC 25925 e, curiosamente, observou-se uma clara inversão dos resultados, sendo que o composto com menor peso molecular e apenas duas cargas, 2.11, apresentou um efeito microbicida praticamente total (6,9 log10) com apenas 5,2 nM de composto. Estudos de microscopia confocal revelaram uma diferença na localização preferencial de cada composto, sendo que o fotossensibilizador 2.8 se localiza maioritariamente na zona planctónica, enquanto que o 2.11 tem a capacidade de difundir para o interior do biofilme, explicando assim a inversão de atividade observada. Adicionalmente, nenhum dos compostos foi tóxico no escuro ou com irradiação em linhas celulares representativas da pele (HDFn – fibroblastos; HaCaT – queratinócitos), nas concentrações utilizadas nos estudos em bactérias planctónicas e biofilmes (5,2 nM-1 µM), tendo apenas sido observada toxicidade em concentrações várias ordens de grandeza acima destes valores. O capítulo 4 descreve a síntese de novos complexos de ferro (II) baseados em carbenos N-heterocíclicos funcionalizados com diversos grupos, com o fim de obter compostos com propriedades anfifílicas distintas com potencial atividade antibacteriana. Para este efeito, desenvolveram-se diversas estratégias sintéticas com vários passos, que conduziram à preparação de complexos de ferro (II) correspondentes a cada pró-ligando (4.6a-e), com rendimentos entre os 68-90%. A atividade antibacteriana destes compostos foi avaliada em estirpes Gram-positivas (Staphylococcus aureus) e Gram-negativas (Escherichia coli), demonstrando um efeito significativo da cadeia lateral do Fe (II) -NHC. O complexo mais lipofílico (4.6b) foi encontrado como sendo o mais ativo contra ambas as estirpes (8 µg/ml). No capítulo 5 descreve-se o design de chalconas com grupos adequados para possuírem atividade antimalárica, de acordo com a análise de estudos estrutura-atividade previamente descritas. Além disso, desenvolveu-se um processo sintético sustentável alternativo, passível de scale-up (testado até 5g), para a síntese destes compostos, permitindo alcançar valores das métricas de sustentabilidade sem precedentes, obtendo-se um fator-E de apenas 4,2 e um Ecoscale de 72. De seguida, a capacidade destes compostos inibirem a infeção de linhas celulares de Huh-7 hepatócitos por Plasmodium berghei foi avaliada usando um protocolo baseado na medição de bioluminescência desenvolvido no Prudêncio Lab da Universidade de Lisboa. Após realização de uma avaliação preliminar, foram calculados os valores de IC50 para os mais promissores, tendo-se concluído que a chalcona mais ativa na fase hepática foi a 5.12, com um IC50= 1,45 ± 0,04 µM. Esta chalcona apresenta uma potência cerca de 7 vezes superior à da Primaquina®, um dos fármacos utilizados no tratamento da fase hepática. No capítulo 6 apresentam-se detalhadamente os procedimentos experimentais referentes a todos os capítulos da tese bem como a caracterização química completa de todas as moléculas sintetizadas no decorrer do trabalho.

The development of new effective treatments for infectious diseases is one of the biggest challenges of Medicinal Chemistry. Given the relevance of this problem, the main goal of the work presented in this Thesis consisted of the design, synthesis, and development of new antimicrobial chemical entities with alternative action mechanisms, in order to give a valuable contribution for the overcoming of this challenge. In this sense, the work was subdivided into two clinical areas of intervention: topic infections caused by bacteria and infections caused by protozoa. In chapter 1, we present a critical literature revision of the different topics and families addressed in this thesis. Furthermore, the objectives of the developed work are presented. Regarding the treatment of infectious diseases caused by bacteria, in chapter 2, we describe the synthesis of new photosensitizers that can be used in a light-activated therapy (aPDT). The work developed in this work focuses on three different families: I – neutral tetrapyrrolic macrocycles (sulfonamido-porphyrins and sulfonamido-bacteriochlorins); II – cationic tetrapyrrolic macrocycles of the imidazolylporphyrin type and III – pyrrolic macrocycles of the (sub)phthalocyanine type. Family I was based in bimodal molecules, containing neutral porphyrins and sulfonamides in their structure, which are compounds with known antibacterial activity. In this family, we selectively synthesized mono-substituted and tetra-substituted porphyrin derivatives of TPFPP by substitution with methanesulfonamide, in controlled reaction conditions, as well as the corresponding bacteriochlorins in good yields (70-90%). Family II is centred in cationic porphyrinic photosensitizers derived from 1-methylimidazole. In this family, we explored synthetic routes to attain efficiently symmetric meso-tetra-imidazolyl-porphyrins and non-symmetric and meso-di-imidazolyl-porphyrins, compounds with similar scaffolds but with different lipophilicity, molecular weights, and number and charge distribution, in order to assess their influence in their antibacterial activity. During the synthesis of the meso-tetra-imidazolyl porphyrin (2.6), some optimizations of the synthetic methodologies were made using the water/Mw method, which allowed a significant decrease in the reaction time and a striking improvement of the process’s sustainability. We performed the cationization of the aforementioned porphyrin, obtaining porphyrin 2.7 and, subsequently, the Zn (II) complex 2.8. The base porphyrin of the group of the non-symmetric meso-di-imidazolyl-porphyrins 2.9 was synthesized by a [2+2] condensation, followed by oxidation, and was obtained in 19% yield. Afterward, we obtained the Zn (II) complex 2.10 and correspondent cationic porphyrin 2.11. Family III was based on phthalocyanines and subphthalocyanines, whose synthesis was started by the modulation of the precursors for both macrocycles, phthalonitriles, with groups that could be cationized. After, we proceeded to the synthesis of Zn (II) metallophthalocyanines and, subsequently, the preparation of the subphthalocyanines with the same substituents. The aminated subphthalocyanines showed poor chemical stability, relatively low molar absorption coefficients and were unable to be cationized. Consequently, the development of this particular family was halted. In chapter 3, the photophysical and photochemical characterization of the previously synthesized compounds was performed, as well as the biological studies in planktonic bacteria and biofilms and also eukaryotic cells. The most promising results were observed for family II, which possessed good light absorption (log ε =5.31-4.29), reasonable capability of ROS production (ɸΔ= 0.18-0.75), as well as high photostability (ɸPd= 4x10–5 and 8x10–6 for 2.8 and 2.11, respectively). Afterward, we performed the studies in planktonic bacteria, and we observed a substantial bacterial inactivation for photosensitizer 2.8, with higher molecular weight, four positive charges and Zn (II) as central metal, allowing a 7 log10 reduction of CFU’s for all tested bacterial strains with 100 to 1000 nM concentrations of photosensitizer. With such promising results, we proceeded towards studies in multiresistant bacteria collected from patients of the Coimbra University Hospital. Again, the degree of inactivation was high, with photosensitizer 2.8 showing high ability to inactivate all tested strains in concentrations as low as 1 µM, which demonstrates the original premise that aPDT has potential for being successfully used in bacterial strains with resistance towards current antibiotics. Hence, we continued our studies with their evaluation in biofilms formed by the strain S. aureus ATCC 25925 and, remarkably, a clear inversion of the results was observed, being the photosensitizer with lower molecular weight and just two charges, 2.11, the most effective with a practically total microbicide effect (6,9 log10) in a concentration as low as 5.2 nM. Confocal microscopy studies revealed a difference in the localization of each compound, having photosensitizer 2.8 a preferential localization in the planktonic region, while 2.11 has the capability to diffuse to the interior of biofilms, which explains the observed inversion of activity. Additionally, none of the compounds were toxic in the dark or with light irradiation in cell lines representative of human skin (HDFn – fibroblasts; HaCaT – keratinocytes), in the concentrations used in both planktonic bacteria and biofilms (5.2 nM to 1 µM), with toxicity having only being observed in concentrations several orders of magnitude above these values. Chapter 4 describes the synthesis of new iron (II) complexes based on N-heterocyclic carbenes functionalized with multiple groups in order to obtain compounds with different amphiphilicities and properties that can act as antimicrobial agents. To this effect, the corresponding iron (II) complexes for each pro-ligand (4.6a-e) were prepared through several sequential synthetic steps in yields between 68-90%. Their antibacterial activity was evaluated in both, Gram-positive (Staphylococcus aureus) and Gram-negative (Escherichia coli) bacteria, which demonstrated a significant influence of the side chain of the Fe (II)-NHC. The most lipophilic compound (4.6b) was found to be the most active towards both tested strains (8 µg/ml). In chapter 5, we describe the design of chalcones with appropriate groups for possessing antimalarial activity, according to the analysis of structure-activity studies previously reported. Moreover, we have developed a sustainable alternative synthetic process, amenable to scale-up (tested up to 5g), for the synthesis of these compounds, allowing the achievement of unprecedented values for green chemistry metrics, namely an E-factor of just 4.2 and an Ecoscale of 72. Afterward, the new synthesized compounds ability to inhibit the infection in Huh-7 hepatocytes’ cell lines by Plasmodium berghei was evaluated, using a protocol based on bioluminescence measurements, developed at Prudêncio Lab, University of Lisbon. After performing a preliminary exploratory screening, the IC50 values were calculated, and we concluded that the most active chalcone in the liver stage of the disease is chalcone 5.12, with an IC50 = 1.45 ± 0,04 µM. This chalcone possesses an activity about 7 times superior to that of Primaquine®, which is one of the drugs used in the treatment of this stage. In chapter 6, we present in detail the experimental procedures referring to all chapters of this thesis, as well as the complete chemical characterization of all molecules synthesized during this work.