Evaluation of potential markers for the diagnosis and prognosis of CADASIL patients

Abstract

A Arteriopatia Cerebral Autossómica Dominante com Enfartes Subcorticais e Leucoencefalopatia (CADASIL, OMIM #125310) é uma doença progressiva e fatal causada por mutações no gene NOTCH3, cuja frequência varia entre populações. Evidências mostram que vários mecanismos patogénicos podem estar na base desta doença que é considerada a doença hereditária de pequenos vasos cerebrais mais comum, com uma nova prevalência recentemente estimada de 1:300. Estudos feitos há mais de 10 anos mostraram que os exões 4, 11, 18 e 19 seriam os mais frequentemente afetados em doentes portugueses com CADASIL. No entanto, nenhum outro estudo foi feito na nossa população de doentes desde então. Contudo, apesar do diagnóstico desta doença ser feito tendo por base o quadro clínico do doente, que inclui AVCs, enxaqueca com aura, deficiências cognitivas e distúrbios psiquiátricos, a sua história familiar e o resultado da ressonância magnética cerebral, a análise genética do gene NOTCH3 deve ser considerada o gold standard do diagnóstico. Devido à grande variabilidade fenotípica observada entre e dentro de famílias CADASIL, torna-se extremamente difícil fazer o prognóstico dos doentes e o tratamento dos mesmos. Por isso, o diagnóstico precoce e a identificação de marcadores com valor prognóstico tornam-se essenciais para possibilitar cuidados preventivos e orientar as decisões de tratamento de doentes. Estudos recentes mostram uma correlação dos níveis de NF-L no soro com a sobrevida, a carga lesional na ressonância e o declínio cognitivo de doentes CADASIL. Neste sentido, o presente estudo foi dividido em duas tarefas principais, começando com a caracterização genética e clínica do nosso cohort de doentes CADASIL, seguida pela avaliação do valor prognóstico dos níveis de NF-L no soro de doentes. Em primeiro lugar, os doentes com diagnóstico clínico de CADASIL foram estudados através de sequenciação por Sanger e/ou NGS. A patogenicidade das variantes identificadas foi posteriormente avaliada usando uma pipeline bioinformática interna. Os níveis de NF-L no soro de doentes CADASIL foram também obtidos usando a tecnologia SiMoA. Foi identificado um total de 53 portadores de uma variante patogénica no gene NOTCH3, dos quais, 20 casos índex, de famílias diferentes, e 33 familiares. A análise molecular revelou 12 mutações diferentes em heterozigotia, das quais oito mutações missense com alteração de um resíduo de cisteína (p.R110C, p.R153C, p.G420C, p.R427C, p.C446F, p.R558C, p.R607C, p.C1099Y), três mutações missense que não afetam resíduos de cisteína (p.S497L, p.S978R, p.V1952M) e uma mutação nonsense (p.R1893*). Embora todas as variantes tenham sido previamente descritas na literatura, foi a primeira vez que a variante p.R1893* foi associada ao fenótipo de CADASIL. É interessante notar que a maior parte dos portadores de uma variante patogénica no gene NOTCH3 eram portadores de variantes localizadas nos exões 8, 11, 20 ou 31 (18,9%, 47,2%, 11,3% e 9,4%, respetivamente), enquanto as demais se encontravam dispersas ao longo de toda a região codificante do gene NOTCH3. Uma análise genética posterior focada em genes associados a um fenótipo de demência, em doentes com um défice cognitivo particularmente severo, revelou dois irmãos com a coocorrência de uma variante patogénica nos genes NOTCH3 (p.G420C) e SQSTM1 (p.S275Ffs*17). Curiosamente, a coocorrência de duas variantes patogénicas nos genes NOTCH3 e SQSTM1 em doentes CADASIL nunca tinha sido reportada antes e sugere uma interação funcional entre as proteínas codificadas por estes genes. Assim sendo, os nossos resultados suportam a hipótese de que múltiplos mecanismos patogénicos possam estar na base desta doença, sugerindo que a análise de toda a região codificante do gene NOTCH3 é relevante para um diagnóstico precoce e preciso de doentes CADASIL. Para mais, a expansão da análise genética a outros genes relacionados com fénotipo dos doentes através do uso de painéis NGS personalizados, poderá proporcionar um melhor aconselhamento genético e tratamento dos doentes. Adicionalmente, os nossos estudos acerca da avaliação do valor prognóstico dos níveis de NF-L no soro revelaram uma correlação significativa entre níveis elevados de NF-L no soro e o aparecimento de sintomas, o défice cognitivo dos doentes e a severidade da doença. Embora estudos futuros sejam necessários para uma melhor compreensão do verdadeiro valor prognóstico deste marcador, os nossos resultados revelam a possibilidade da monotorização da eficácia terapêutica e do prognóstico de doentes através da medição dos níveis de NF-L no soro.

Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL, OMIM #125310) is a fatal and progressive disease caused by mutations in the NOTCH3 gene which vary in their frequency across populations. Evidence point that multiple pathogenic mechanisms underlie the disease, which is considered the most common inherited cerebral small vessel disease, with a recent new estimated prevalence of 1:300. More than 10 years ago, studies showed exons 4, 11, 18, and 19 to be the most frequently mutated in CADASIL Portuguese patients. However, since then, no further studies have been done on our population. Although the clinical presentation of this disorder, including stroke, migraine with aura, cognitive impairment, and psychiatric disturbances, together with the family history and brain MRI confirms the diagnosis, genetic analysis of NOTCH3 gene should be used as a final gold standard. Due to the high phenotypic variability both across and within CADASIL families, it is extremely difficult to predict the patients’ prognosis and management. Therefore, an early diagnosis and the identification of prognostic markers are essential for preventive care and guiding treatment decisions. Moreover, recent studies have shown a correlation between NF-L serum levels and patients’ survival, MRI burden, and cognitive decline. In line with this, the present study was divided in two main tasks, starting with the genetic and clinical characterization of our CADASIL patients’ cohort, followed by the evaluation of the potential of sNF-L values in the prognosis of CADASIL patients. First, the patients with the clinical diagnosis of CADASIL underwent genetic testing, using Sanger and/or NGS sequencing. The identified variants were further evaluated for their pathogenicity using an in-house bioinformatic pipeline. NF-L serum levels of NOTCH3 mutation carriers and a control group were also determined using SiMoA technology. A total of 53 NOTCH3 mutation carriers were identified. Of those, 20 were index cases from different families and 33 were relatives. The molecular analysis revealed 12 different heterozygous mutations in which eight were missense cysteine altering mutations (p.R110C, p.R153C, p.G420C, p.R427C, p.C446F, p.R558C, p.R607C, p.C1099Y), three were missense cysteine sparing mutations (p.S497L, p.S978R, p.V1952M) and one was a nonsense mutation (p.R1893*). Although all identified variants had been previously reported in the literature, it was the first time that p.R1893* has been associated with CADASIL phenotype. Interestingly, most NOTCH3 mutation carriers harbored a variant located in exon 8, 11, 20, or 31 (18,9%, 47,2%, 11,3%, and 9,4% respectively), while the remaining variants were dispersed over the entire NOTCH3 coding sequence. A further genetic analysis focused on the genes associated with dementia phenotype, performed in patients who developed a particular aggressive cognitive impairment, revealed two siblings with the co-occurrence of a pathogenic variant in NOTCH3 (p.G420C) and SQSTM1 (p.S275Ffs*17) genes. Interestingly, double pathogenic variants in both NOTCH3 and SQSTM1 genes have never been reported so far in CADASIL patients and suggest a functional interaction between these encoded proteins. Thus, our results support the hypothesis of multiple pathogenic mechanisms underlaying CADASIL, suggesting that sequencing of the entire coding region of the NOTCH3 gene is relevant for an early and accurate diagnosis of CADASIL patients. Also, the expansion of genetic analysis to other genes associated with the clinical phenotype using NGS-customized gene panel assay might be helpful to provide a better genetic counseling and patient management. Furthermore, our studies concerning the evaluation of the prognostic value of NF-L serum levels revealed a significant correlation between high NF-L serum levels and disease onset, patients’ cognitive impairment, and disease severity. Although future studies to a better notion of the true prognostic value of this marker are needed, our results suggest the ability of NF-L serum levels to predict patients’ prognosis and also to monitor therapeutic efficiency.