Preparation and Preclinical Evaluation of New Ursane-type Triterpenoids

Abstract

Over the past few decades, tremendous progress has been made in the understanding, prevention and treatment of cancer. However, despite this progress, the incidence of cancer appears to be increasing. Therefore, there is an urgent need for the development of new chemotherapeutic agents with improved selectivity, efficacy and safety profiles. Numerous studies have highlighted the enormous anticancer potential of triterpenoids. In particular, pentacyclic triterpenoids have been shown to modulate multiple intracellular signaling pathways and exert chemopreventive and antitumor activities in various in vitro and in vivo model systems. Madecassic acid, a pentacyclic triterpenoid of plant origin, has been reported to possess a variety of pharmacological activities. However, only a few studies have attempted to explore the therapeutic potential of this natural compound, particularly regarding to its anticancer activity. In light of this observation, a series of new semi-synthetic derivatives of madecassic acid were designed, synthesized and evaluated for their in vitro cytotoxic activities, to identify promising lead compounds for the development of new anticancer drug therapies. The preparation of new madecassic acid derivatives was designed to follow three main synthetic strategies. The first one focused mainly on the functionalization of the C-2, C-3, C-6 and C-23 hydroxyl groups and the C-28 carboxylic acid. The second one aimed at the conversion of the 6-membered ring into a 5-membered ring with an α,β-unsaturated aldehyde substituent. Finally, the third semi-synthetic strategy was based on the introduction of different substituents at the C-2 position of the pentameric ring. All synthesized compounds were fully characterized using infrared radiation, nuclear magnetic resonance and mass spectrometry techniques, and their anticancer activity was evaluated against the US National Cancer Institute's 60 human cancer cell line (NCI-60) panel using the sulforhodamine blue colorimetric assay. Several analogs exhibited broad-spectrum cytotoxic activities over all nine tumor types represented in the panel, with more potent antiproliferative activities observed against select cancer cell lines, including multidrug-resistant phenotypes. Among them, compound 3.30, a cyclic enol ether derivative bearing a 2-furoyl moiety at C-3, exhibited sub-µM potencies against 26 different tumor cell lines from the NCI-60 panel. The mechanism of action of this compound was predicted by CellMinerTM bioinformatic analysis and confirmed by biochemical and cell-based experiments to involve inhibition of the DNA replication process and disruption of mitochondrial membrane potential. Furthermore, compounds 4.3, 4.7 and 4.10 displayed potent and highly differential antiproliferative activity against 80% of the tumor cells harboring the B-RafV600E mutation within the nanomolar range. Structure-activity analysis revealed that a 5-membered A-ring containing an α,β-unsaturated aldehyde substituted at C-23 with a 2-furoyl group seems to be crucial to produce this particular growth inhibition signature. In silico analysis of the cytotoxicity pattern of these compounds identified two highly correlated clinically approved drugs with known B-RafV600E inhibitory activity. Follow-up analysis revealed inhibition of the extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway through the reduction of rapidly accelerated fibrosarcoma (Raf) protein levels is a key mechanism of action of these compounds. Among these derivatives, compound 4.10 was the most potent compound in suppressing tumor growth of B-RafV600E-mutant cell lines and displayed the highest reduction of Raf protein levels. The 23-methanesulfonyloxy derivatives 5.5 and 5.7 showed different modes of action with broad cytotoxicity seen for compound 5.5 but some selectivity of cellular response seen for compound 5.7. CellMinerTM analysis revealed that compound 5.5 elicits a unique profile of growth inhibitory-responses on cancer cell lines, indicating a potentially novel mechanism of anticancer action; whereas it identified the tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 (Tdp1) as a potential target of compound 5.7. Taken together, this work contributed to a deeper understanding of structure-activity relationship and chemical reactivity of madecassic acid derivatives. Moreover, it demonstrated the remarkable potential of madecassic acid derivatives, such as compounds 3.30, 4.10, 5.5 and 5.7, as promising leads for the development of new cancer therapies.

Nas últimas décadas tem-se assistido a um tremendo progresso na compreensão, prevenção e tratamento do cancro. No entanto, apesar deste progresso, a incidência do cancro parece estar a aumentar. Há, portanto, uma necessidade premente de desenvolver novos agentes anticancerígenos com melhores perfis de seletividade, eficácia e segurança. Vários estudos têm destacado o enorme potencial anticancerígeno dos triterpenóides. Em particular, os triterpenóides pentacíclicos parecem modular múltiplas vias de sinalização intracelular e exercer atividades quimiopreventivas e antitumorais em vários modelos in vitro e in vivo. O ácido madecássico, um triterpenóide pentacíclico de origem vegetal, demonstrou possuir uma ampla variedade de atividades farmacológicas. No entanto, poucos estudos tentaram explorar o potencial terapêutico deste composto natural, principalmente no que diz respeito à sua atividade anticancerígena. Perante este enquadramento, uma série de novos derivados semi-sintéticos do ácido madecássico foi idealizada e sintetizada e as suas atividades citotóxicas foram avaliadas in vitro, com o objetivo de identificar leads promissores para o desenvolvimento de novas terapias anticancerígenas. A preparação de novos derivados do ácido madecássico foi baseada em três principais estratégias sintéticas. A primeira focou-se principalmente na funcionalização dos grupos hidroxilos a C-2, C-3, C-6 e C-23 e do ácido carboxílico a C-28. A segunda visou a conversão do anel A de seis membros num anel de cinco membros com um substituinte aldeído α,β-insaturado. Finalmente, a terceira estratégia semi-sintética baseou-se na introdução de diferentes substituintes na posição C-2 do anel pentamérico. Todos os compostos sintetizados foram totalmente caracterizados usando técnicas de radiação infravermelha, ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa, e as suas atividades anticancerígenas foram avaliadas num painel de 60 linhas celulares tumorais humanas do Instituto Nacional do Cancro dos Estados Unidos (NCI-60) utilizando o ensaio colorimétrico da sulforodamina B. Vários análogos exibiram atividades citotóxicas de amplo espectro nos nove tipos de tumores representados no painel, com atividades antiproliferativas mais promissoras observadas em linhas celulares selecionadas, incluindo fenótipos multirresistentes a fármacos. Entre estes, o composto 3.30, um derivado éter enólico cíclico com um substituinte 2-furoílo em C-3, exibiu actividades sub-µM em 26 linhas de células tumorais do painel NCI-60. O mecanismo de ação deste composto foi determinado utilizando a ferramenta bioinformática CellMinerTM e confirmado por experiências bioquímicas e celulares, envolvendo a inibição do processo de replicação do ADN e a alteração do potencial da membrana mitocondrial. Além disso, os compostos 4.3, 4.7 e 4.10 exibiram atividade antiproliferativa promissora e altamente diferencial dentro da gama nanomolar em 80% das células tumorais avaliadas que possuem a mutação B-RafV600E. Uma análise da relação estrutura-atividade revelou que um anel de cinco membros contendo um aldeído α,β-insaturado substituído em C-23 por um grupo 2-furoílo parece ser crucial para produzir esta assinatura específica na inibição de crescimento. A análise in silico do padrão de citotoxicidade destes compostos identificou dois fármacos clinicamente aprovados altamente correlacionados e com reconhecida atividade inibidora do B-RafV600E. Uma análise posterior revelou que a inibição da via de sinalização da quinase regulada por sinal extracelular (ERK) através da redução dos níveis de proteína do fibrossarcoma rapidamente acelerado (Raf) é um mecanismo de ação chave desses compostos. Entre estes derivados, o composto 4.10 foi o mais potente na supressão do crescimento tumoral de linhas celulares mutantes B-RafV600E e exibiu a maior redução dos níveis de proteína Raf. Os derivados de 23-metanossulfoniloxi 5.5 e 5.7 exibiram diferentes modos de ação, com ampla citotoxicidade observada para o composto 5.5, mas alguma seletividade de resposta celular observada para o composto 5.7. A análise dos resultados obtidos com recurso ao CellMinerTM revelou que o composto 5.5 provocou um perfil único de inibição de crescimento nas linhas celulares tumorais, indicando um mecanismo de ação anticancerígena potencialmente novo, enquanto identificou a tirosil-ADN fosfodiesterase 1 (Tdp1) como um potencial alvo do composto 5.7. Em conclusão, este trabalho contribuiu para uma compreensão mais aprofundada da relação estrutura-atividade e reatividade química dos derivados do ácido madecássico. Além disso, demonstrou o notável potencial dos derivados do ácido madecássico, em particular o dos compostos 3.30, 4.10, 5.5 e 5.7, como leads promissores no desenvolvimento de novas terapias contra o cancro.