Dinâmica de concentração do óxido nítrico produzido no hipocampo de rato por activação de receptores do glutamato

Abstract

O óxido nítrico (•NO) é um radical de natureza gasosa que foi identificado na década de 1980 como um mensageiro intercelular ubíquo nos sistemas cardiovascular, imunitário e nervoso. As suas propriedades físico-químicas claramente distintas de mensageiros conhecidos e a sua bioactividade diversa despertaram um interesse neste radical livre que até hoje, 15 anos depois de ter sido classificada pela revista Science como a molécula do ano de 1992 (Koshland, 1992), não se esgotou. De facto, embora o impacto do •NO em órgãos e sistemas seja conhecido em termos gerais, os mecanismos moleculares e, sobretudo, aspectos quantitativos relacionados com a produção e difusão são ainda pouco conhecidos. O •NO, como espécie difusível e hidrofóbica (Lancaster, 1997, Shaw e Vosper, 1977), permeia membranas biológicas e não é, portanto, armazenado em vesículas. Por outro lado, não existe um receptor membranar para o •NO. Um dos alvos mais bem estudados e de cuja actividade resultam acções bem conhecidas como, por exemplo, a vasodilatação e a neuromodulação, é a guanilato ciclase solúvel (Arnold et al., 1977). Deste modo, a sua bioactividade é criticamente determinada pelo perfil da sua concentração no tempo e no espaço. Contudo, e pese embora o elevado número de trabalhos dedicados ao estudo dos efeitos do •NO, muito pouco se conhece sobre a sua dinâmica de concentração. Em larga medida, tal limitação deve-se às dificuldades analíticas associadas à medição de uma espécies gasosa com tempo de vida reduzido em sistemas biológicos. O conhecimento da sua actividade biológica é limitado pelo facto da maioria dos estudos implicarem a adição de •NO exogenamente ou a medição de produtos da sua actividade biológica (cGMP) ou reacção/metabolização (por exemplo nitrito) e não o •NO propriamente dito. O hipocampo é uma estrutura do cérebro onde a actividade do •NO parece ter um impacto extraordinário em virtude do seu envolvimento, por um lado, nos mecanismos de memória e aprendizagem enquanto mensageiro retrógrado e, por outro lado, nas vias de morte celular em doenças neurodegenerativas. O estudo da dinâmica da concentração do •NO nesta região reveste-se, portanto, de um grande interesse. No trabalho aqui apresentado, foram construídos e avaliados microeléctrodos de fibra de carbono revestidos com polímeros de Nafion® e orto-fenilenediamina para medir •NO em fatias de hipocampo de rato. Tendo-se comprovado as suas boas propriedades electroanalíticas foram utilizados no estudo da dinâmica de concentração do gás produzido por activação da sua principal via síntese, o receptor glutamatérgico do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA). Demonstrou-se que, tal como previsto considerando as respectivas características funcionais e susceptibilidades, existe uma heterogeneidade de produção de •NO nas subregiões do hipocampo, com uma resposta significativamente superior em CA1. Esta subregião apresentou também uma taxa de consumo de oxigénio (O2) superior às restantes. Atendendo a que, com base em estudos enzimáticos e em culturas celulares, o •NO tem sido proposto como um regulador fisiológico do consumo mitocondrial de O2 devido à sua ligação rápida e reversível com o complexo terminal da cadeia transportadora de electrões, a citocromo c oxidase, estudou-se a interacção dinâmica entre •NO endógeno e a pressão parcial de O2 na subregião CA1 através da medida simultânea de ambos os gases. Os resultados apresentados, e obtidos pela primeira vez num sistema que preserva a citoarquitectura tecidual, revelaram uma relação mútua e complexa dos perfis de ambos em consequência da estimulação do tecido com NMDA. Por fim, apresenta-se pela primeira vez, em tecido do sistema nervoso central, uma determinação experimental da dimensão da esfera de difusão de •NO para uma situação de activação de múltiplos locais de síntese contidos num volume com raio interior a 100 μm. Coincidindo com cálculos teóricos apresentados na literatura, o raio de difusão é de pelo menos 400 μM.

Nitric oxide (•NO) is a gaseous free radical identified as a ubiquitous intercellular messenger in the cardiovascular, immune and nervous systems in the 1980s. Its unique physical-chemical properties and diverse bioactivity triggered a still lasting interest in this free radical elected “Molecule of the Year 1992” by the prestigious scientific magazine Science (Koshland, 1992). Although NOs actions in organs and systems are understood in general terms, little is known concerning molecular mechanisms and quantitative information regarding production and diffusion. Due to its diffusible and hydrophobic nature (Lancaster, 1997, Shaw e Vosper, 1977) •NO easily crosses membranes and is not stored in vesicles. On the other hand, no membrane receptor has been identified for •NO. One well characterized target, with known implications in the regulation of vascular tone and neuromodulation, is soluble guanylate cyclase (Arnold et al., 1977). Thus, bioactivity is critically determined by its concentration profile in time and space. Despite the large number of studies directed at understanding NOs actions, little is known regarding its concentration dynamics. This is greatly been due to the analytic difficulties associated with measuring a gaseous species with a limited life-time in biological systems. Much of what is now known about •NO and its actions in biological systems is based on studies where •NO was applied exogenously or quantified indirectly by measuring either products of its activity (cGMP) or reaction/metabolism (nitrite). The hippocampus is a structure of the central nervous system where •NO has an extraordinary hall due to its involvement not only in memory and learning mechanisms as a retrograde messenger, but also in cell death pathways associated with neurodegenerative disorders. Determining the concentration dynamics of •NO in this particular region is highly important. Here, carbon fiber microelectrodes coated with polymers of Nafion® and ortho-phenylenediamine for measuring •NO were constructed and evaluated and, having established their adequate analytical properties, used to determine •NOs concentration dynamics evoked by activation of the N-methyl- D-aspartate glutamate receptor. As predicted by their different functional characteristics and susceptibilities, the subregions of the hippocampus were shown to be heterogeneous regarding •NO production, with CA1 showing the highest yield. Considering that in both enzymatic and cell culture studies •NO as been shown to be a physiological regulator of oxygen (O2) consumption due to fast and reversible binding to cytochrome c oxidase, the terminal complex of the electron transporting chain, the cross-talk between O2 and endogenously produced •NO was studied in the CA1 subregion of the hippocampus. The results shown demonstrate, for the first time in a preparation retaining original cyto-architecture, a complex interaction between the two as a result of NMDA receptor activation. Last but not least, for a neuronal tissue preparation, the diffusion radius of •NO was experimentally determined for the activation of multiple production sites contained in a 100 μm radius. In agreement with several theoretical calculations present in the literature, the radius of the •NO diffusion sphere was determined to be at least 400 μm.