Pathways for the Synthesis and Hydrolysis of some Compatible Solutes in the Bacterium Rubrobacter xylanophilus and in the Plant Selaginella moellendorffii : characterization of some recombinant enzymes

Abstract

Organisms that face osmotic stress have long been known to accumulate small organic molecules that do not perturb cell function, even when at high concentrations. Such molecules are typically called ‘compatible’ solutes and permit cells to adjust the turgor pressure required for metabolism and survival of organisms. Compatible solutes are fundamental molecules, accumulated or synthesized by cells, in the response several stress conditions and are viewed as general stress protectants. Rubrobacter xylanophilus is known to accumulate a rare combination of compatible solutes, being trehalose and mannosylglycerate the major solutes and constitutively accumulated. The present work describes the biochemical characterization of three enzymes involved in the synthesis of trehalose, the major accumulated compatible solute, in this thermophilic radiation-resistant actinobacterium. Although Rubrobacter xylanophilus possesses a total of four trehalose biosynthetic pathways, we functionally characterize two systems which we have shown to be active in cell extracts, under the conditions tested, namely trehalose-6-phosphate synthase/trehalose-6-phosphate phosphatase (Tps/Tpp) and the glycosyltransferring synthase (TreT). Two of the described enzymes are involved in the most common pathway, the Tps/Tpp pathway, which has been reported in organisms of the three domains of life. This pathway involves two enzymatic steps; Tps catalyzes the transfer of glucose from GDP-glucose to glucose-6-phosphate (Glc6P), forming trehalose-6-phosphate (T6P) and GDP, while Tpp dephosphorylates T6P to trehalose and inorganic phosphate. Both enzymes showed high substrate specificity: Tps, for the combination of GDP-glucose and Glc6P, and Tpp for T6P. The thirdly characterized enzyme, designated TreT, coexists with Tps/Tpp pathway in R. xylanophilus and promotes the formation of trehalose from several nucleoside diphosphate (NDP)-glucoses and glucose. The favorite donor substrate was reported to be ADP-glucose, but only glucose served as an acceptor molecule. The proposed main function of the TreT enzyme in R. xylanophilus is to preferentially catalyze trehalose formation, although it is also able to reverse catalysis, hydrolyzing trehalose, but with much less efficiency. IV The biosynthetic pathway for the other compatible solute mostly accumulated in this bacterium, mannosylglycerate, has been recently described by Empadinhas and co-workers (2011). To withstand osmotic stress, plants accumulate and synthesize compatible solutes, which help to maintain the structure of enzymes, membranes and other cellular compounds. Mannosylglycerate and glucosylglycerate were not accumulated by the plant Selaginella moellendorffii, under the examined conditions, even though the genes coding for their synthesis and hydrolysis were identified in the plant’s genome. The biosynthesis and hydrolysis of mannosyglycerate and glucosylglycerate in S. moellendorffii are described in this work. The S. moellendorffii mannosylglycerate synthase (MgS) catalyzes the synthesis of glycerate derivatives, mannosylglycerate and glucosylglycerate, when GDP-mannose or GDP-glucose were glucosyl donor substrates, respectively. Glycoside hydrolase, designated as mannosylglycerate hydrolase (MgH), is highly specific for the hydrolysis of both mannosylglycerate and glucosylglycerate. This thesis unravels the identity of genes and enzymes involved in the synthesis and hydrolysis of the compatible solutes trehalose, mannosylglycerate and glucosylglycerate, in two phylogenetically unrelated organisms and furthers our understanding on how these important compounds are synthesized and hydrolyzed. The thesis results pave the way for future studies on the function and regulation of these molecules in the physiology of these organisms.

A adaptação a ambientes com salinidade elevada pressupõe, para muitos organismos, a acumulação de pequenas moléculas orgânicas, que não interferem com o metabolismo celular, mesmo quando a sua concentração é elevada. Estas moléculas, designadas solutos “compatíveis”, permitem que as células ajustem a sua pressão de turgescência, condição necessária ao metabolismo e à sobrevivência dos organismos. Os solutos compatíveis são moléculas fundamentais captadas do exterior ou sintetizadas pelas células em resposta a condições ambientais agressivas, sendo consideradas moléculas protectoras. A bactéria Rubrobacter xylanophilus é conhecida por acumular uma rara combinação de solutos compatíveis, sendo a trealose e o manosilglicerato os principais (acumulados constitutivamente). O presente trabalho descreve a caracterização bioquímica de três enzimas envolvidas na síntese do soluto compatível trealose nesta actinobactéria termofílica e extremamente resistente a radiações. Embora a bactéria Rubrobacter xylanophilus possua quatro vias de síntese para a trealose, apenas duas foram caracterizadas, por se ter demonstrado estarem funcionalmente activas em extratos celulares, nas condições testadas: a via trealose-6-fosfato sintetase/trealose-6-fosfato fosfatase (Tps/Tpp) e a via da enzima sintetase que transfere um grupo glucosil (TreT). Duas das enzimas caracterizadas estão envolvidas na via Tps/Tpp, sendo esta a via mais comum, uma vez que existe em organismos dos três Domínios da Vida. A via Tps/Tpp inclui duas reacções enzimáticas catalisadas pelas enzimas Tps e Tpp. A enzima Tps catalisa a transferência de glucose de GDP-glucose para glucose-6-fosfato (Glc6P), formando trealose-6-fosfato (T6P) e GDP, enquanto a enzima Tpp desfosforila T6P, formando trealose e fosfato inorgânico. Ambas as enzimas mostraram ter uma elevada especificidade em relação aos substratos: a enzima Tps, relativamente à combinação GDP-glucose e Glc6P, e a enzima Tpp, relativamente à T6P. A terceira enzima caracterizada designa-se por TreT. Esta enzima co-existe com as enzimas da via Tps/Tpp na bactéria R. xylanophilus e promove a formação de VI trealose a partir de vários nucleosídeos difosfato (NDP)-glucose (dador) e glucose (receptor). O substrato preferido, dador do grupo glucosil, foi descrito ser ADP-glucose; contudo, a glucose foi a única molécula receptora. A função da enzima TreT em R. xylanophilus é, preferencialmente, catalisar a formação de trealose, embora também seja capaz de a degradar, mas com uma eficiência muito menor. A via biossintética para o soluto compatível manosilglicerato, também acumulado por esta bactéria, foi recentemente descrita por Empadinhas e colaboradores (2011). Para lidar com o stress osmótico, as plantas também acumulam solutos compatíveis que ajudam a manter a estrutura das membranas celulares, das enzimas e de outros compostos. Os solutos manosilglicerato e glucosilglicerato não são acumulados por Selaginella moellendorffii, nas condições estudadas, embora os genes que codificam as enzimas para a sua síntese e hidrólise tenham sido identificados no genoma desta planta. As vias para a síntese e hidrólise de manosilglicerato e glucosilglicerato em S. moellendorffii são descritas neste trabalho. A sintetase de manosilglicerato (MgS) da planta S. moellendorffii catalisa a síntese dos derivados de glicerato, manosilglicerato e glucosilglicerato, quando a GDP-manose ou a GDP-glucose são substratos dadores do grupo glucosil, respectivamente. A hidrolase, designada por manosilglicerato hidrolase (MgH), é altamente específica para a hidrólise dos dois compostos manosilglicerato e glucosilglicerato. Esta tese permitiu identificar os genes e caracterizar as respectivas enzimas recombinantes envolvidas na síntese e na hidrólise dos solutos compatíveis trealose, manosilglicerato e glucosilglicerato em dois organismos filogeneticamente não relacionados, possibilitando, assim, a compreensão de como estes compostos são sintetizados e hidrolisados. Os resultados deste trabalho permitem abrir caminho a futuros estudos sobre a regulação e a função das referidas moléculas na fisiologia destes organismos, com possíveis implicações importantes tanto a nível da investigação fundamental como da investigação biotecnológica.