Control of migration of neural stem cells by calpain signaling

Abstract

Calpains are ubiquitous calcium-dependent cysteine proteases. Calpains are best known for the cleavage of proteins during excitotoxic cell death (del Cerro et al. 1994, Bednarski et al. 1995), which translates into a strong participation of calpains in the loss of brain tissue in either acute situations, like stroke, traumatic brain injury or seizures (Araujo et al. 2008), or in slow progressing disorders like Alzheimer’s, Parkinson’s or Huntington’s disease (Vanderklish & Bahr 2000, Wu et al. 2004). One function described for calpains is their role in cell adhesion, motility and migration (Stifanese et al. 2006). Rho GTPases are described as targets of calpains and are involved in the regulation of cytoskeleton modification. Recently, Rho GTPases were linked to the enhanced spreading of platelets in μ-calpain(-/-) mice (Kuchay et al. 2012). In turn, extracellular signal-regulated kinase (ERK) is part of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway and is also described as involved in cell migration (Anand-Apte et al. 1997, Klemke et al. 1997, Webb et al. 2000). However, the involvement of calpains, Rho GTPases and ERK in the proliferation and migration of neural stem cells (NSC) during neurogenesis in the adult central nervous system remains elusive. Another important factor is the possible involvement of integrins in NSC migration. Integrins appear described as being involved in the process of remodeling the cytoskeleton (Hynes 1992), and on this way they could be involved in NSC migration. Previous work by our group demonstrated that inhibition of calpains increases migration rates of cultured NSC and subventricular zone (SVZ) explants. However, the signaling pathways involved in this process remain to be identified. Based on these assumptions, we investigated the signaling pathways by which calpains modulate adult neural stem cell migration, in cultures of NSC isolated from the SVZ. For this purpose, we assessed whether calpain modulation of the activity of the Rho GTPases Cdc42, Rac1 and RhoA, ERK signaling pathway and integrin signaling is involved in the regulation of SVZ-derived NSC migration. On the other hand, we also analyzed cell migration in the rostral migratory stream (RMS) of brain sections from wild-type and calpastatin-deficient mice (CSTN). Our data suggests that Cdc42 and Rac1, but not RhoA or the ERK signaling pathway, are involved in the migration of NSC. Moreover, we show that integrins are important for the migration of these cells, as well as laminin. On the other hand, calpains seem to be modulating Rho GTPases as well as integrins signaling. In addition to that, our in vivo studies show that the absence of calpastatin leads to a decrease in doublecortin (DCX) immunoreactivity along the RMS, which is translated to an impairment of cell migration from the SVZ to the olfactory bulbs. This suggests that calpains negatively regulate the migration of NSC.

As calpaínas são proteases cisteínicas ubíquas dependentes de cálcio. Estas proteases estão amplamente descritas como envolvidas na clivagem de proteínas durante a morte celular por excitotoxicidade (del Cerro et al. 1994, Bednarski et al. 1995), o que se traduz numa participação clara das calpaínas em processos de perda de tecido cerebral, como no caso de situações agudas, tais como isquémia cerebral, traumatismo crânio-encefálico ou convulsões (Araujo et al. 2008), ou em patologias de progressão lenta, como o caso das doenças de Alzheimer, Parkinson ou Huntington (Vanderklish & Bahr 2000, Wu et al. 2004). Uma função descrita para as calpaínas é o seu papel na adesão, motilidade e migração das células (Stifanese et al. 2006). As Rho GTPases estão descritas como alvos das calpaínas, e estão envolvidas na regulação das alterações que ocorrem a nível do citoesqueleto. Recentemente, as Rho GTPases foram identificadas como intervenientes no aumento do spreading das plaquetas em murganhos knock-out para as μ-calpaínas (Kuchay et al. 2012). Por sua vez, a via de sinalização da proteína cinase regulada por sinais extracelulares (ERK), que faz parte da via de sinalização das proteína-cinases activadas por mitogénios (MAPK), também se encontra descrita como envolvida na migração celular (Anand-Apte et al. 1997, Klemke et al. 1997, Webb et al. 2000). No entanto, o envolvimento das calpaínas, Rho GTPases e da ERK na proliferação e migração das células estaminais neurais (NSC) durante o processo de neurogénese no sistema nervoso central adulto permanece por esclarecer. Um outro facto que permanece por elucidar é o envolvimento das integrinas na migração das NSC. As integrinas estão descritas como envolvidas em processos de remodelação do citoesqueleto (Hynes 1992), podendo estar a intervir no processo de migração das NSC. Resultados preliminares do nosso grupo mostraram que a inibição das calpaínas leva a um aumento da migração das NSC em cultura e em explantes da região subventricular (SVZ). Contudo, as vias de sinalização envolvidas neste processo permanecem por ser identificadas. Com base nestes pressupostos, investigámos as vias de sinalização através das quais as calpaínas modulam a migração das NSC, em culturas de NSC isoladas da SVZ. Neste sentido, fomos avaliar se a modulação pelas calpaínas da actividade das Rho GTPases Cdc42, Rac1 e RhoA, da via de sinalização ERK e das integrinas está envolvida na regulação da migração das NSC derivadas da SVZ. Foram feitos ainda estudos de migração celular ao longo da via migratória rostral (RMS) in vivo, usando animais wild-type e animais geneticamente modificados (CSTN) que não possuem o inibidor endógeno das calpaínas, a calpastatina. Os nossos resultados sugerem que a Cdc42 e a Rac1 estão envolvidas na migração das NSC, ao contrário do que acontece no caso da RhoA e da via da ERK. Para além disso, também mostramos que as integrinas são importantes para que a migração destas células ocorra, assim como a laminina. Por outro lado, as calpaínas parecem estar a actuar sobre a sinalização das Rho GTPases e sobre a sinalização pelas integrinas. Além disso, os nossos estudos in vivo mostraram que na ausência do inibidor endógeno das calpaínas ocorre uma diminuição na imunoreactividade da doublecortin (DCX) ao longo da RMS, o que se traduz numa diminuição da migração celular da SVZ até aos bolbos olfactivos. Isto sugere que as calpaínas exercem um efeito negativo na regulação da migração das NSC.