Premotor enteric nervous system impairment in an experimental Parkinson model

Abstract

It has been thoroughly demonstrated that rodents treated intranasally with 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) exhibit time-dependent impairments in olfactory, emotional, cognitive and motor functions associated with disruption of dopaminergic neurotransmission across brain structures which possibly recapitulate those observed during different stages of Parkinson's disease (PD). Although autonomic dysfunction, such as constipation, has potential sensitivity as a clinical biomarker of the premotor phase, it has been overlooked. The aim of this study was to evaluate the intestinal function before motor impairment, using this intranasal MPTP rat PD model. To this end, ileum segments from male Wistar rats (21 weeks old) were collected 7 days following the MPTP administration for functional studies. Isometric contractile concentration-response (CR) curves (cumulative) for dopamine (DA) were performed in both the presence and the absence of sulpiride, which is a selective dopamine D2-like receptors (D2R) antagonist. Ilea samples were also collected for the assessment of the dopaminergic status by measuring total DA content (HPLC) and also tyrosine hydroxylase (TH), which is the rate-limiting enzyme in DA biosynthesis and D2R density (WB). Moreover, immunohistochemical studies were performed on isolated rat ileum not only to analyze the S100β protein (enteroglial intestinal inflammation marker) immunostaining, but also to characterize the cellular location of D2R while assessing possible alterations between treated and untreated animals. Functional studies showed biphasic DA CR curves for both saline and MPTP-treated rats, evidencing contraction for lower DA concentrations (0.01 to 0.9 μM) and relaxation for higher concentrations (3 to 90 μM). However, MPTP imposed a statistically significant decrease in the maximum contractile effect in the DA CR curves compared to saline. Within saline group, there was a statistically significant difference between DA CR curves performed in the presence and in the absence of the D2R antagonist. On the other hand, no such difference was obtained in the MPTP-treated group. This is highly suggestive that MPTP is perturbing D2R-dependent ileum function. The dopaminergic dysfunction occurs with preserved DA homeostasis as shown by normal DA levels and both TH and D2R ileal expression levels. S100β immunoreactivity was observed within the saline group in smooth muscle cells and ganglion cells of both submucosal and myenteric plexus, while MPTP induced a tendency to an immunostaining decrease in the submucosal plexus relatively to the myenteric plexus, when comparing to the saline group. In addition, D2R immunoreactivity tends to be higher in the myenteric plexus when compared to submucosal plexus in the saline animals. In turn, within the MPTP-treated group, only representative histological sections of three out of six treated animals showed immunoreactivity in the myenteric plexus. Overall, the obtained results lead to the existence of an early gut dopaminergic dysfunction that is in place following i.n. MPTP administration. This GI dysfunction may not be directly related to DA total content, since DA homeostasis was preserved in the ileum, but it might be specifically connected to a D2R dysfunction in the myenteric plexus, caused by the neurotoxin.

Tem sido demonstrado que os roedores tratados com 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP), por via intranasal, exibem deficiências dependentes do tempo após a exposição à neurotoxina, nas funções olfactiva, emocional, cognitiva e motora associadas a perturbações da neurotransmissão dopaminérgica em estruturas cerebrais, possivelmente mimetizando as alterações observadas durante as diferentes fases da doença de Parkinson (PD). Embora a disfunção autonómica, tal como a obstipação, tenha potencial como biomarcador clínico da fase pré-motora, esta tem sido negligenciada até agora. O objetivo deste estudo foi avaliar, neste modelo de PD em rato com administração intranasal de MPTP, a função intestinal antes de haver comprometimento motor. Para esse fim, segmentos do íleo de ratos Wistar machos (21 semanas de idade) foram colhidos para estudos funcionais, 7 dias após a administração de MPTP. Foram executadas curvas cumulativas concentração-resposta (CR) de dopamina (DA) (0.01-90 μM) tanto na presença como na ausência de sulpiride, um antagonista selectivo dos recetores dopaminérgicos tipo 2 (D2). Foram também colhidas amostras de íleo para a avaliação da via dopaminérgica, através da medição do conteúdo total de DA (HPLC), da expressão da tirosina-hidroxilase, enzima envolvida no passo limitante da síntese de DA, bem como da expressão do receptor D2 (D2R) da DA (WB). Segmentos de íleo de rato foram ainda utilizados em técnicas de imunohistoquímica quer para analisar a imunomarcação da proteína S100β, um marcador enteroglial de inflamação intestinal, quer para caracterizar a localização celular dos D2R, avaliando simultaneamente possíveis alterações entre os animais tratados e não tratados. Os estudos funcionais mostraram uma resposta bifásica à DA tanto em ratos salinos como tratados com MPTP, evidenciando-se contração para concentrações mais baixas de DA (0.01 to 0.9 μM) e relaxamento para concentrações mais elevadas (3 to 90 μM). Contudo, o MPTP reduziu significativamente o efeito contráctil máximo nas curvas CR de DA comparativamente ao grupo salino. Houve ainda, no grupo salino, uma diferença estatisticamente significativa entre as curvas CR de DA realizadas na presença e na ausência do antagonista dos D2R. Em contrapartida, nenhuma diferença foi observada no grupo tratado com MPTP, sugerindo que o MPTP perturba a função do íleo dependente dos D2R. A disfunção dopaminérgica ocorre com a homeostase da DA preservada, como o demonstram os níveis de DA, e a expressão de TH e de D2R no íleo. A imunomarcação para a proteína S100β foi observada no grupo salino em células do músculo liso e células ganglionares de ambos os plexos submucoso e mientérico, enquanto no grupo MPTP se observou tendencialmente uma diminuição no plexo submucoso relativamente ao mientérico, quando comparada com o grupo controlo. É ainda de referir que a imunomarcação dos D2R tende a ser mais elevada no plexo mientérico quando comparado com o plexo submucoso nos animais controlo. Por sua vez, no grupo tratado com MPTP, apenas secções histológicas representativas de três dos seis animais tratados apresentaram imunomarcação no plexo mientérico. Em suma, os resultados obtidos permitem inferir a existência de uma disfunção dopaminérgica precoce no intestino após a administração de MPTP. Esta disfunção gastrointestinal não estando diretamente relacionada com o conteúdo total de DA, uma vez que a sua homeostase foi preservada no íleo, pode estar especificamente ligada a uma disfunção dos D2R no plexo mientérico, causados pela neurotoxina.